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1、第三章 参与DNA复制的酶类及DNA复制的调控 第一节 参与DNA复制的酶类 DNA复制过程非常复杂，至少有20多种酶与蛋白质参与。 一、DNA聚合酶(DNA polymerase) (一)作用机理 DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸合成DNA，即催化前一个脱氧核苷酸3OH与后一个脱氧核苷酸5P之间形成3,5-磷酸二酯键的反应，从而延长DNA链，链延伸方向为53，添加脱氧核苷酸的种类按碱基互补原则由模板DNA决定。 DNA聚合酶需要互补于DNA模板上的一小段RNA作引物，由引物提供DNA合成时需要的第一个3OH。因此DNA聚合酶需要的条件包括4种dNTP底物、Mg2、模板DNA和引物（图3-1）。
2、,图3-1 DNA聚合酶的催化作用,DNA聚合酶与3OH端周围的单链DNA模板结合， 若进入的脱氧核苷酸的碱基与模板配对，该底物则结合到酶的三磷酸结合部位上。 在聚合酶催化下，引物链的3OH对底物的5P进行亲核攻击，释出焦磷酸根，形成磷酸二酯键，新生链由此延长一个核苷酸，酶沿着模板链向前移动一个核苷酸距离。 如此重复，直至酶到达模板终点。在体内释放的焦磷酸被焦磷酸酶水解，使反应平衡趋向DNA合成.,2005年12月Science报道了DNA聚合酶高保真机理的新发现。高保真聚合酶除具有广为人知的校正功能外,最近实验进一步表明, 由不能及时校正或难于纠正的错配碱基引发“关闭” DNA聚合反应的效应
3、, 同样保证了DNA聚合反应终产物纯度。 高保真聚合酶这一“关闭” DNA聚合反应的能力, 促成其与耐外切酶消化3末端敏感区碱基特异性引物共同构成一个SNP敏感性纳米级复合分子“开/关”，高保真聚合酶分子中相距三纳米聚合中心和3端敏感区 5端敏感区外切酶酶解中心则既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的效能:对配对的引物，则直接在该酶聚合中心进行聚合反应，即“开”的效应；,而对于3 末端敏感区错配的引物，则从该酶聚合中心转移至3末端敏感区 5 末端敏感区外切酶酶解中心，由于引物修饰了3 末端敏感区耐外切酶的特点，继而出现了一种长时间无酶解产物的酶解过程，最后因酶聚合中心空转而“关”闭
4、DNA聚合反应，即“关”的效应。 这一新的复合分子“开/关”在很大程度上满足了后基因时代对SNP分析的要求。该SNP分子开关的应用, 使基因诊断提高到单碱基水平。同时, 利用该方法通过SNP对基因组扫描, 在单基因遗传病病因研究及法医学鉴定上具有很强的理论和实用价值。,2006年7月Nature报道新发现突变相关的DNA聚合酶(Pol)可能导致DNA复制保真度下降而参与突变形成。 除人细胞中已知的5种Pol，Pol、，Pol、的复制保真度很低。可能在遗传不稳定形成中有作用。近两年来，据原核和低等真核细胞复制后修复(PRR)途径的研究成果，在人细胞中克隆了5个新的Pol:Pol 、和Rev1编码
5、蛋白。 大肠杆菌SOS反应中的非定标性突变的发生与dinB基因有关。DinB蛋白有Pol活性(Pol )，无35校读功能。高表达时可导致非定标性突变明显升高达上千倍。无损伤模板掺入错误率达10-310-4；大肠杆菌跨损伤DNA合成依赖于UmuD2C复合体，其中介导的途径通常是易误性的，它的突变引起诱发突变频率的抑制。,UmuD2C复合体也具有Pol活性(称为Pol V)。它在损伤或未损伤DNA模板皆表现为高度易误性，能有效跨越DNA上无碱基部位(abasic site)并优先插入一个腺嘌呤。 酿酒酵母PRR途径有三个独立旁路(一个易误，两个无误)。基因REV1、REV3和REV7与易误性旁路有
6、关。其中Rev3和Rev7蛋白构成Pol，Rev1蛋白为有DNA模板指导的dCMP转移酶活性，因此也是一种Pol。 在芽生酵母中的两条无误PRR途径依赖RAD5和RAD30基因。RAD30基因与大肠杆菌的DinB和UmuC和酿酒酵母中的Rev1基因同源。它可在DNA合成时在嘧啶二聚体的对面正确掺入两个腺嘌呤。它是一个保真度很低的Pol，其掺入差错率高达10-2到10-3。,这些与突变形成密切相关的Pol在人细胞中都找到了相应的同源物基因，与酵母中的REV3同源的hREV3编码的Pol以及与Rev1同源的基因；与大肠杆菌中的DinB和酵母RAD30同源的hDinB基因编码Pol；与大肠杆菌Umu
7、C和酵母RAD30同源的hRAD30基因编码Pol、另一与酵母RAD30同源的hRAD30B编码的Pol。已证明着色性干皮病变型(XPV)系Po1的突变所致。 这些新发现的Pol，可能与诱发的细胞遗传不稳定的形成有关。我们证明用反义核酸技术阻断Pol表达的细胞系MNNG诱发的非定标性突变的频率减低。,(二)原核生物DNA聚合酶 在大肠杆菌体内发现了三类DNA聚合酶，根据发现时间顺序分别命名为DNA聚合酶、。 1.DNA聚合酶I 大肠杆菌DNA聚合酶I是第一个被鉴定的DNA聚合酶，它由polA基因座编码，是一个103kD的单链多肽。每个大肠杆菌细胞中约有400个分子DNA聚合酶I。 当底物和模板
8、存在时，聚合酶I可使脱氧核糖核苷酸依次加到具有3-OH末端的多核苷酸链上。它的催化需要引物链（DNA或RNA链）的存在。在37条件下，每分子DNA聚合酶I每分钟中催化约1000个核苷酸的聚合。,DNA聚合酶I是一个多功能酶，它可以催化以下的反应： （1）DNA链沿53方向延长（DNA聚合酶活性）。 （2）从3端水解DNA链（35核酸外切酶活性）。 （3）从5端水解DNA链（53核酸外切酶活性）。 （4）具有很强的校对功能（ 35核酸外切酶活性）。 （5）有切口平移功能（53核酸外切酶活性）。 用蛋白水解酶将DNA聚合酶I作有限水解，可得到分子量68kD和36kD的两个片段。,较大的断裂产物（6
9、8kD）叫Klenow片段，在体外它可催化DNA的合成反应，Klenow片段有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，两种活性分别处于片段的不同区域。 C端的2/3片段具有聚合酶活性，N端的13片段有核酸外切酶活性，在蛋白质中，两个活性位点的距离为3nm，表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。 小片段（35kD）有53核酸外切酶活性，可以切除少量的核苷酸，一次最多切除10 个硷基。,该酶在切除由紫外线照射而形成嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA的半不连续合成中，冈崎片段5-端RNA引物的切除可能也依赖于该外切酶，小亚基的外切酶活性和大亚基的聚合校对功能协同作用，使DNA聚合酶I在体外具有从切口
10、处起始复制的独特能力，而其他DNA聚合酶不具备这种能力。 在双链DNA的磷酸二酯键断裂处，DNA聚合酶I可延伸3末端，合成新的DNA片段后，DNA聚合酶I可置换双螺旋中已有的同源链。,置换出的同源链被53核酸外切酶降解。除部分片段被新合成的材料取代且缺口位置沿双螺旋移动外，DNA性质没有任何改变。 该反应在实践中很有意义，体外的切口移位是在DNA分子上引入放射性标记核苷酸的重要技术，在体内，53聚合酶合成活性和35核酸外切酶活性主要用来填充DNA双链中短的单链区域，复制过程中或从DNA中切除受损的硷基后会产生这些单链区域。,2.DNA聚合酶II DNA聚合酶II是一条分子量为120KD的多肽链
11、。该酶活性很低，只有DNA聚合酶I的5。它也以4种脱氧核苷酸为底物，按53方向合成DNA。DNA聚合酶II具有35核酸外切酶活性，但无53外切酶活性。它在DNA修复中起一定作用。 3.DNA聚合酶III 尽管细菌中存在大量的DNA聚合酶I，但它并不是复制的主要酶。在polA的突变型中，复制仍可继续进行。 目前，DNA聚合酶III（PolIII）被认为是真正负责大肠杆菌细胞内DNA合成的复制酶。 DNA聚合酶III是多个亚基组成的蛋白质，细胞中含量很少，在每个细胞中只有1020个拷贝的全酶。 PolIII全酶由、10种不同的亚基组成，至少含3种重要的酶活性。,核心聚合酶（core polymer
12、ase）由、三种亚基组成，其中亚基分子量为130kD，由dnaE编码，具有53的聚合活性，每秒可以合成8个核苷酸。 亚基具有35核酸外切酶的校对功能，由dnaQ编码合成。在体内亚基基本功能是保证复制的忠实性，这可由dnaQ突变体的表型所证实，在细菌株中突变发生的概率增加了1000倍。亚基常与亚基形成一个紧密的1：l复合物，协同发挥功能。 细胞中大约有40分子核心酶，其中只有一半被组装到全酶中,核心酶活性较低，以大约每秒20个核苷酸的速度合成DNA。,二聚体：亚基是以二聚体的形式存在，在复制过程中二聚体环绕着DNA，并能在DNA上自由滑动，构成一个滑动钳。 滑动钳可把全酶束缚在DNA模板上，从而
13、保证高度的进行性，当pol结合钳时，全酶的进行性可从每次聚合10个核苷酸提高到每次聚合50000个核苷酸，聚合反应速度从每秒20个核苷酸上升到每秒750个核苷酸，因此钳的存在对大肠杆菌染色体高效复制是十分重要的，亚基可以很容易从全酶中脱离。 与核心酶相比，在细胞中亚基含量很丰富，大约每个细胞中含300个二聚体。,复合物：复合物（complex）是滑动钳的载体,可帮助滑动钳结合到DNA上。复合物含有5个不同亚基，形成一种化学计量为21111的结构。和亚基是由不同基因编码产生的不同蛋白质。复合物有依赖DNA的ATP酶活性。 二聚体自己并不能组装到DNA上 ，它是通过复合物与ATP协同作用催化ATP
14、的水解而组装到DNA上。 DNA聚合酶、均具有53聚合酶活性和35核酸外切酶活性，因此在合成DNA时，能识别和切除不配对的引物末端，起着严格校对作用，以保证复制的真实性。,DNA聚合酶的特别之处在于它具有53外切酶活性。这种活性只作用于双链DNA，从5-端切除寡核苷酸。由于它能跳过几个核苷酸起作用，因此能切除由紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体，参与DNA损伤的修复。 DNA聚合酶能催化切口平移和链置换反应,双链DNA的一条链发生断裂，出现切口，DNA聚合酶与切口结合，其53外切酶活性与聚合作用同时发生。即它一边催化3-OH与三磷酸核苷酸产生聚合反应，一边在5端逐一水解核苷酸，切口就沿着DNA链从
15、53方向移动。这种移动称为切口平移（nick translation）（图3-2）。,图3-2 DNA聚合酶I的切口平移,如果选择合适的实验条件，使聚合作用发生在单链切口处而不同时出现53外切酶活性，这种延伸中的链就置换了亲链，即所谓链置换反应，这被认为是遗传重组机制中的一个重复步骤。 在迄今所知的大肠杆菌聚合酶中，唯有DNA pol能独立地进行链置换反应。其它链置换反应中，需要辅助蛋白，并裂解ATP为解螺旋提供能量。,利用切口平移反应，可获得标记的DNA探针。 将DNA聚合酶、带有切口的双链DNA分子以及放射性标记的三磷酸脱氧核糖核苷一起反应，可合成带有放射性标记的DNA探针，而同时降解未被标记的DNA。 DNA聚合酶在DNA损伤时表达增加，还参与SOS修复反应，能以损伤的DNA链为模板合成新生链。这种特性易于造成DNA的永久突变。 表3-1总结了原核生物三种DNA聚合酶的特性和功能。,表3-1 原核生物DNA聚合酶性质比较,(三)真核生物DNA聚合酶 真核生物中现已发现五种DNA聚合酶，分别命名为.等。 它们的基本性质与原核生物DNA聚合酶相似，其活性依赖于带有3OH的引物、DNA模板和4种dNTP。表3-2列出了真核生物DNA聚合酶的基本特性和功能。,表3-2 真核生物DNA聚合酶性质总结,二、真核生物DNA
