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1、生物技术,Biotechnology,食品与营养工程学院 李西腾,第八章 转基因生物外源基因 表达及其安全性,一 转基因生物外源基因表达,二 转基因生物的安全性及其风险评估,第一节 转基因生物外源基因表达,一、外源基因表达系统 转基因生物技术或称基因工程的最终目的就是要在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有重要价值的产品，基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。,（一）原核生物的外源基因表达系统,外源基因在原核细胞中的表达就是使克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地合成基因产物。,（一）原核生物的外源基因表达系统,1原核生物基因表达的特点 同所有的生命过程
2、一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程：即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。,（一）原核生物的外源基因表达系统,与真核细胞相比，原核生物的基因表达有下列特点： 原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有3种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA 的合成。 原核生物的基因表达是以操纵子为单位的，即由数个相关的结构基因及其调控区结合构成1个基因表达的协同单位。,（一）原核生物的外源基因表达系统,由于原核生物无核膜，转录与翻译是偶联的，二者也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA ，转录成mRNA后可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。 原核基因一般不含内含子，在
3、原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此，当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成的mRNA前体后，其中的内含子部分就不能被切除。,（一）原核生物的外源基因表达系统,原核基因表达的控制主要是在转录水平，这种控制比对基因产物的直接控制要慢。 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上有1个转译的起始密码子及同16s核糖体RNA 3末端碱基互补的序列即S-D序列是真核基因所没有的。,（一）原核生物的外源基因表达系统,2、外源基因在原核细胞中表达的基本条件 通过表达载体将外源基因导入宿主菌。 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件。 外源基因不能带有间隔序列(内含子)。 外源基因与载体
4、连接后必须形成正确的开放阅读框架。 利用宿主菌的调控系统。,（一）原核生物的外源基因表达系统,3、原核细胞中基因的重要表达调控元件 (1)启动子 启动子是DNA链上能与RNA聚合酶结合并能起动m RNA合成的核苷酸序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。 (2)终止子 在1个基因的3末端或是1个操纵子的3端还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为终止子。,（二）真核生物的外源基因表达系统,1真核生物基因及表达的主要特点 与原核生物不同，真核生物基因表达具有程序、时间和空间上不同层次的严格、精密的控制，这是由真核基因的复杂性决定的。 真核细胞与
5、原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面都存在很大的差异，真核生物在基因结构及表达方面有着与原核生物不同的特点。,（二）真核生物的外源基因表达系统,1真核生物基因及表达的主要特点 基因组DNA的存在形式使基因转录的启动一般不具备快起始的能力，大多数真核DNA都与蛋白质结合成紧密结构，不像原核DNA是裸露的。 真核生物一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。 真核基因的转录和翻译在细胞的不同部位，转录在细胞核内进行面翻译在细胞质中进行，两者既有间隔又有联系，不像原核基因在同一部位进行转译。,（二）真核生物的外源基因表达系统,1真核生物基因及表达的主
6、要特点 原核基因转录的调节区小且位于启动子上游不远处，真核基因的调节区不仅要大得多而且可能远离启动子达数百甚至上干个碱基。 真核基因中间含有不被翻译的内含子，大多数真核基因的初级转录本不具有功能，需在细胞的一定部位进行剪接加工形成各种中间产物，因而可以通过是否加工mRNA前体来调控基因的表达。 真核基因的表达受到多层次的精密调节，比原核基因复杂得多，也涉及更多的蛋白质因子的参与。,（二）真核生物的外源基因表达系统,2真核基因的重要表达调控元件 真核基因在其表达的转录、转录后加工、翻译、翻译后蛋白的加工、运输及定位等各个环节都取决于一系列重要调控元件的作用，外源基因的表达正是通过这些调控元件来实
7、现的。 (1)启动子（2）增强子（3）终止子（4）修饰序列,（二）真核生物的外源基因表达系统,3真核生物外源基因表达系统 (1)瞬时表达系统 在此系统中外源基因没有稳定的整合到宿主细胞染色体中，而是以染色体外的DNA形式存在，因此外源基因只能得到瞬时表达。 (2)诱导表达系统 诱导型基因表达系统对子认识基因在生长发育、生理活动及其病理过程中的作用都具有重要的意义。,（二）真核生物的外源基因表达系统,3真核生物外源基因表达系统 (3)组成型特异表达系统 乳腺表达系统 膀胱生物反应器 血液表达系统,二、外源基因对转基因生物遗传的影响,转基因技术使人们能够按照自己的意愿，对生命最基本的遗传物质进行直
8、接操作，把所需要的目的基因导入细胞内，使生物体获得新的性状。外源基因被导入宿主并整合进受体DNA后，一旦遗传表达，将表现出新的遗传性状。由于外源基因进入，与内源基因发生相互作用，可能使转基因生物中的外源基因甚至内源基因的遗传表达受到一定影响。,二、外源基因对转基因生物遗传的影响,（一）转基因生物中外源基因的丢失 在基因工程的研究和应用过程中，发现有时在第一代转基因生物体内可以检测出外源基因的存在，在第二代、第三代也还可以检测出来，但在后面几代中就检测不到了，即发生了外源基因丢失。,二、外源基因对转基因生物遗传的影响,（二）转基因生物中外源基因的次生效应 外源基因的次生效应是指由于外源基因的插入
9、而对宿主体内某些基因的表达所产生的影响。 目前的技术不能够准确控制外源基因在宿主染色体上的插入位点，所以外源基因可能插入到宿主基因组中的非编码区、结构基因或调控区，从而产生插入突变，预期的结果也就显现不出来。 常见的次生代谢效应有两种情况：一是由于外源基因的插入导致宿主体内某一基因失活；二是由于外源基因的插入将宿主体内某一基因激活。 由于目前的科学技术水平还很难准确预测一个外源基因在新的遗传背景下会发生什么样的相互作用，因此对外源基因的次生效应尚无法进行控制和预测。,二、外源基因对转基因生物遗传的影响,（三）转基因生物中的基因沉默 外源基因整合后不仅可能引起宿主体内某些基因的失活，外源基因自身
10、也很容易被受体基因组存在的修饰与限制系统所识别并加以修饰和抑制，造成失活和沉默。 形式包括：顺式失活和反式失活两种。,二、外源基因对转基因生物遗传的影响,（四）转基因生物中外源基因的逃逸 转基因生物体内整合的外源基因以某种途径转移到其他生物体内或环境中，这种现象称为外源基因的逃逸。 外源基因逃逸的途径： 转基因作物花粉的散布，这种途径是转基因植物中外源基因逃逸的主要渠道之一； 转基因生物分泌物或残骸在环境中的残留； 食物链的传递。,二、外源基因对转基因生物遗传的影响,（五）外源基因在后代中的遗传多样性 外源基因在后代中的遗传多样性因转基因个体杂交或转基因个体自交结合。 一般来说，外源基因的传递
11、遵循孟德尔遗传规律，自交后代表现31的分阁规律，杂交后代表现1：1的分离规律。但是在某些情况下，作为两个不连锁的显性基因在自交后代中也有表现出151的分离现象。另外，有一个特殊现象是自交一代符合31分离规律，但自交二代却不符合孟德尔分离规律。,三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）影响外源基因表达的主要因素 1、有效的转录起始 这是外源基因能否在宿主细胞中表达及其效率的关键步骤之一，起始的速率是基因表达的主要限速步骤，启动子的强弱及相关的调控序列将影响外源基因的表达与否及其表达效率。,三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）影响外源基因表达的主要因素 2、有效延伸和转录终
12、止 外源基因的转录一旦起始，接下来的问题是如何保证mRNA的有效延伸、终止以及稳定的积累(尤其在真核细胞中)。然而，在转录物内的衰减和非特异性终止可诱发转录中的mRNA分子提前终止。,三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）影响外源基因表达的主要因素 3、mRNA的稳定性 是翻译出蛋白质的模板，mRNA的稳定校直接关系到翻译产物的多少，即表达的效率。 4有效的翻译起始 和有效的转录起始一样，有效的翻译起始是外源基因表达的关键，起始密码子、核糖体结合位点及其相关核苷酸序列对翻译起始至关重要。,三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）影响外源基因表达的主要因素 5、遗传密码应用
13、的偏倚性 不同基因对遗传密码的应用并不是随机的，高表达的基因经常使用偏倚性密码，即使用其常用密码有更高的表达效率。 6mRNA的二级结构 无论是原核基因还是真核基因的表达，翻译的起 始经常受到mRNA不适当的二级结构的影响(如5端非翻译区的茎环二级结构)。,三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）影响外源基因表达的主要因素 7、RNA转录后加工 绝大多数真核基因含有内含子，需在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA。 8mRNA序列上终止密码的选择 所有三个终止密码子在它们的终止效率上是不同的，UAA在高水平表达中终止效率最好，若采用一串联的终止密码效果更好。,三、影响外源基因表达的
14、主要因素及其调控策略,（一）影响外源基因表达的主要因素 9、表达载体的拷贝数及稳定性 在多数情况下，目标基因的扩增程度与基因表达效率成正比。表达载体的稳定性是维持基因表达的必要前提条件，而表达载体的稳定性不但与自身特性有关，也与受体细胞特性密切相关。 10外源蛋白的稳定性 外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累 而不被内源蛋白酶水解，这是基因高效表达的一个重要参数。,三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（二）外源基因表达调控的策略 1、提高外源基因在原核细胞表达的策略 (1)提高翻译水平 (2)减轻细胞的代谢负荷 (3)提高表达蛋白的稳定性，防止外源蛋白被降解。,三、影响外源基因表
15、达的主要因素及其调控策略,（二）外源基因表达调控的策略 2、提高外源基因在真核细胞表达的策略 （1）转录前（基因水平）调控 （2）转录水平调控 （3）转录后调控 （4）翻译水平调控,四、基因表达调控技术,（一）反义RNA 1概念 反义RNA(antisense RNA)是指与靶RNA(多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，它通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与基因的表达调控。,四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）反义RNA 2反义RNA 的调控方式 (1)在核酸复制水平上 反义RNA可作为DNS复制的抑制因子，它可与引物DNA前体互补结合，抑制DNA的复制，从而控制复制的频
16、率。 (2)在转录水平上 反义RNA与mRNA 5端互补而阻止RNA的转录。 (3)在翻译水平上 反义RNA在翻译水平上的调控主要表现在三个方面：一是与mRNA 5端非翻译区包括S-D序列的结合，直接抑制翻译；二是与mRNA 5编码区，主要是起始密码子AUG结合，抑制翻译起始；三是靶mRNA 的非编码区互补结合，间接抑制mRNA 的翻译。,四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（一）反义RNA 3反义RNA 的应用 (1)植物学研究中的应用：控制果实成熟；提高植物抗病性；改变花卉的颜色；控制植物淀粉的合成；控制油料植物种子中脂肪酸的合成；控制雄性不育。 (2) 反义RNA在动物及人类疾病治疗上的应用：对疾病基因的具有调控作用；在人类疾病治疗中的应用。,四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略,（二）基因敲除 1概念 基因敲除(gene knock out)是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其他序列相
