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1、第十五章 干细胞 第一节 概述,一、干细胞的定义和分类 干细胞是具有自我更新和产生分化后代两种基本特性的细胞. 机体由两类不同的组织和器官构成。一类由体细胞组成,另一类是以生殖细胞为主,包括一些由体细胞组成的组织和器官构成。前者执行机体生命活动的各种生理功能;后者一切为了保证卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命。 自我更新指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化后代指干细胞可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞, 另一个开始走上分化道路的定向祖细胞。,早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞, 包
2、括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞. 而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。 干细胞分为两类： 一类干细胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EGC)； 另一类是先在成年
3、组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为组织干细胞(tissue stem cells) ,又称成体干细胞(adult stem cells) 。,二、干细胞(stem cells)与个体发育 正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。 从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官, 这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program) ,被记录在细胞基因组的结构中.不同物种有不同的遗传程序。 在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年
4、和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞。 干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,即细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。,三、胚胎干细胞研究简史 从50年代开始,人们就寻找既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全能性(totipotency)或多能性 (pluripotency),并通过适当条件诱导分化为各种类型分化细胞的模型。50年代末美国发育生物学家
5、Stevens 将着床前发育阶段的小鼠胚胎或12天胚龄的胚胎生殖嵴移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系。EC细胞具有恶性生长又具早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。70年代 EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型, 后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。 80年代初,英国Evans和及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系。90年代初
6、,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系。98年美国威斯康星大学Thomson等人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养,首次成功建立了5株人类ES细胞系,同年, John Hopkins医学院Shamblott等人从5 -9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。,第二节 胚胎干细胞 胚胎干细胞是指早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞。 一、ES和EG细胞培养、建系技术 体外培养建系技术以小鼠的最为成熟,基本原则是有赖于获得全
7、能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。 由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性问题。目前常用的细胞分化抑制物有3种：饲养层细胞(feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium) ,如BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) ,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外,也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,如白介
8、素6 (lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同样可维持小鼠ES细胞的不分化.,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类：饲养层培养法和无饲养层培养法。 (一)饲养层细胞培养法 不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞. 不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。 常用的饲养层细胞有下列两种: 一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days pos
9、t coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素C (mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。 另一种是来自SIM小鼠 (S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷(ouabain, O )有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(LIF)。,(二)无饲养层培养法 以添加某些特定细胞的条件培养液和LIF生长因子至含胎牛血清(FCS)的正常培养液,替代饲养层细胞。 有3种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养： 直接在ES细胞
10、基础培养液中加入重组生长因子和LIF等。 Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)。 2 -3周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH - CM) 。 一般以2 -3份上述细胞条件培养液加1 - 2份新鲜的ES细胞培养液,再添加10% - 20%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。 但在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高。,(三) ES和EC细胞的体外培养 1. ES细胞 不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异, 如猪ICM细胞生长与 小鼠不一样,生长速率慢,且有一个休眠(quiescent)期。因此
11、,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。 如一般小鼠多选用3 -4 d的囊胚或2 - 3 d的桑椹胚,猪取8 - 10 d 的囊胚,绵羊取8 -9 d的囊胚,人和牛取7 -8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。 基本培养液为含15% - 20% FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和50IV/mL青霉素、50g/mL链霉素的DMEM液.将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35 mm培养皿中。培养2 -3天后按下列方法之一分离出ICM细胞进一步培养.
12、,方法一：免疫手术法(immunosurgery). 由于4 - 4.5 dpc的小鼠囊胚由己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC),能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解. 囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H - 2b)。再移到新鲜豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状,发生免疫溶解;而ICM细胞不具H -2b抗原,不发生免疫溶解,故细胞完整元损。ICM细胞经Hanks液洗涤后,
13、移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培液的板内进一步培养。,方法二:常规培养 桑椹胚或囊胚在铺有MEF饲养层的DMEM基本培养液中,未去透明带的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM细胞团从贴壁的囊胚内长出来。吸出ICM细胞团,用0.25% (m/V)胰蛋白酶(trypsin)和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在370C消化5 min.部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的24孔培养板, ICM细胞首先出现贴壁生长,继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的ES细胞团.用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团,并继续培养,一般4 -5 d间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化ES细胞,视
14、ES细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。 ES细胞在培养过程中,有时在巢状干细胞团周边出现少量分化细胞,这时除了需继续维持饲养层细胞外,在培液中再添加适量的LIF生长因子,可克服细胞进一步分化的现象。,ES细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种生长因子,例如表皮生长因子(ECF) ,可促进细胞DNA合成和 mRNA转录,使细胞周期的S期提前,周期缩短;胰岛素样生长因子(ICF)对ICM细胞有促进增殖作用; 干细胞生长因子(SCF)对干细胞有调控和促分裂作用,同时可抑制细胞凋亡。此外,在培液中还需添加还原剂-巯基乙醇,可使血清中的含硫化合物还原成谷胱甘肽,以消除ES细胞培养
15、过程中产生的毒性过氧化物,同时,-巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。 2. EG细胞 PGC取材根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。 小鼠EG细胞建系基本过程如下：收集8. 5 - 10. 5 dpc小鼠胚胎,在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织,以0.02% EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织,37 0C, 15 min.吸管轻吹打散,接种于铺有MEF或STO饲养层细胞的4孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。,生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,4 - 6 d后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移
16、至新的饲养层细胞上,继续培养增殖。 重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞,经过同上2 -3次过程,可产生巢状(nests)生长的干细胞集落。最后将它转移到铺有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。 EG细胞的饲养层常用STO细胞,培养液基本同ES细胞,但除LIF外还要添加干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。 二、ES和EG细胞系基本特性 (一)体外能无限增殖 建系后的ES细胞在体外培养不仅能存活,还能无限增殖,是干细胞自我更新特性在体外培养中的延续。但实际上,传代次数愈多,ES细胞会像常规细胞一样,出现核型不正常的情况,并失去了ES细胞原有的一些重要特性。,129品系小鼠的ICM细胞非常容易建立ES细胞系,而其他品系的小鼠不容易,说明遗传因素制约ES细胞建系。 (二)体外产生分化细胞 产生分化细胞是干细胞基本特性在体外培养中的延续。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,因此,ES和EG细胞体外培养的首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保维持其多能性的培养体系。 ICM细胞一般接种于铺有灭活的小鼠MEF细胞作为饲养层的琼脂平板上,加有含抑制分化的L
