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1、第四章 植物胚胎培养,第1节 胚胎培养的内容与意义 第2节 胚乳培养 第3节 胚珠及子房培养 第3节 离体授粉,第4章 植物胚胎培养,胚胎培养：是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。 胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括：受精以后的胚珠子房培养、未受精胚珠和子房培养,胚珠的结构和胚囊的形成,胚胎培养的意义,A.克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 植物远缘杂交时，经常出现花粉在异种植物上不萌发，或虽萌发但不能正常生长，或虽生长但不能伸入子房等不亲和现象，或胚乳发育不良导致杂种幼胚败育等
2、。 杂交不孕现象是远缘杂交的一个难点。 杂交不亲和可通过试管受精技术解决；幼胚败育 可通过胚培养技术解决。,B. 打破种子休眠，缩短育种年限。 主要有以下两种： （1）使种胚发育不全的植物获得后代。例如天麻、 兰花种子成熟时，胚只有6-7个细胞，利用离 体培养可以打破休眠提早萌发。 （2）使含抑制性物质不发芽的种胚发芽。苹果属离 体胚培养48h即可萌发，而用种子则要9个月,C、使生活力低下或无生活力的种子萌发 许多落叶果树，特别是杂交种产生早熟、生活力低下甚至无活力的种子，利用胚胎培养可使种子萌发，提高萌发率。例如桃、芭蕉、山芋等。 D、使柑橘类植物合子胚正常发育 这类植物种子内存在大量的珠心
3、胚，珠心胚生活力很强，往往得不到合子胚后代，影响杂交育种结果，利用胚培养可以尽早取出合子胚进行培养，从而获得杂种后代。,E、获三倍体或单倍体植株 因被子植物胚乳细胞大多为三倍体，胚乳培养可以获得三倍体植株，从而使植物胚胎培养成为一种新的育种途径，用于果树、瓜类等经济作物产生无子果实。另外，对远缘杂种的胚进行培养时，可以通过染色体消失法获得单倍体。 F、用于基础研究 研究胚胎发育过程、胚胎发生的条件以及影响因素，胚乳生长发育及形态建成过程。,胚培养,胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。,胚的类型,合子胚：由受精卵形成
4、的胚,非合子胚,体细胞胚：,孤雌胚：,不定胚：由植物组织或器官直接产生的体细胞胚。,孤雄胚：,由小孢子或花粉粒形成的胚,在离体或活体条件下由除合子 之外的孢子体细胞形成的胚,由未受精卵形成的胚,（一）胚龄与胚性发育的关系,一般胚龄越大，对培养条件越宽松，离体培养的成功率就越高，相反胚龄越小成功率越低。 1、培养已分化的成熟胚，只需要提供简单的营养元素，即在含无机盐和糖的培养基上，即可萌发生长。 2、培养未分化完全的幼胚，一般要求完全异养的条件。培养基中除要有无机盐和糖外，还要提供维生素、氨基酸等有机成分以及植物激素等。,（1）成熟胚的特征,成熟胚一般具有完整的胚结构。 胚芽、胚根、胚轴等都已得
5、到分化，子叶也大致形成。 成熟胚不需要脱分化可直接成苗。 成熟胚只要提供适宜的生长条件，打破休眠，胚体即可直接萌发形成健壮的幼苗。 培养过程要避免脱分化，为此，在培养中应避免损伤胚，培养基中也应避免使用易诱导产生愈伤组织的植物激素，如2,4-D。 对培养条件要求宽松。,2、成熟胚培养过程-以玉米成熟胚培养为例,1）玉米种子消毒 2）在黑暗条件下，将种子放在含无菌湿润滤纸的培养皿中培育6h。 3）将吸涨的种子在无菌培养皿内将胚分离出来 4）无菌水冲洗3次 5）在MS培养基中暗培养。 6）观察：2d出现胚根，3-4 d出现胚芽，10d长成幼苗。,玉米成熟胚的培养,（1）成熟胚培养 植物胚胎发育经过
6、： 原胚期 球形胚期 心形胚期 鱼雷胚期 子叶期 成熟期 成熟胚一般指子叶期以后至发育完全的胚(胚芽、胚轴、胚根、子叶)。,植物胚胎发生过程： 原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚,球形胚前期,心型胚前期,鱼雷胚,球形胚,成熟胚培养较易成功，在含有无机元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。 由于种子外部有较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。,（2）幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来
7、越深入和广泛。 Laibach在19251929年间，通过培养亚麻种间杂种幼胚，成功地获得了种间杂种，首次证实了这种方法在实际应用中的价值。,李继侗，1933年在银杏培养中发现了胚乳提取物能够促进银杏离体胚的生长。这一发现为后人使用植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然物质促进培养物生长具有启示作用。 随着组织培养技术的不断完善，幼胚培养技术也在进步，现在可使心形期胚或更早期的长度仅0.1-0.2mm的胚生长发育成植株。现在幼胚培养成功的有大麦、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。,二 、培养方法,1、材料的选择与灭菌 取回大田或温室里种植的杂交植物的子房，用70%的酒精进行几秒钟表面消毒，再用0.1%
8、HgCl2灭菌1030min，无菌水冲洗，即可用于外植体的分离和培养。,取材时期 大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体）。,(A) globular (B) heart shaped, (C) torpedo,幼胚剥离 胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。 有关胚发育的细胞学和生理生化研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育，特别是球形期以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。另外胚柄促进幼胚离体生长的作用能被
9、浓度为5mg/L的赤霉素（GA）有效取代。,培养条件的控制 剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。 在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。,2、幼胚的分离及培养,幼胚的剥离 幼胚的培养 胚胎发育过程分为两个时期： 1）异养期（heterotrophy period），即在胚发育早期，幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 2）自养期(autotrophy period) ，胚在代谢上已经能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长，在营养上已相当独立。,Monnier(1976,1978)介绍了一种培养方法,胚乳看护培养 Z
10、iebur等 (1951)报道，在进行大麦未成熟胚离体培养 时，培养基上存在来自同一物种另一种子的离体胚乳，对胚 的生长有明显的促进作用。 谷类胚胎嫁接的研究发现，当大麦胚移植到小麦的胚乳上 时，比在大麦胚乳上生长更好。 Kruse(1974)在某些属间杂交中，若把杂交未成熟的胚放 在事先培养的大麦胚乳上培养，能显著提高获得杂种植株的 频率。 大麦（Hordeum vulgare）黑麦(Secale cereale)属间杂交，采用这种方法有30%40%的杂种未成熟胚可以发育成苗，而用传统的胚培养法只有1%能成功。,（2）幼胚离体培养的生长发育方式 胚性发育(embryonal developm
11、ent) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。,早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发（未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟萌发）。 在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。,愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培
12、养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。,（3）离体幼胚培养的影响因素 培养基 胚的成熟程度不同，所用培养基的类型也不同。 成熟胚的培养基有：Tukey、White等。 未成熟胚有：Rijven、Nitch、MS等。,培养基的渗透压对幼胚培养至关重要，渗透压的调节主要依赖糖。 常用的是蔗糖，不同发育时期的胚要求蔗糖的浓度不同，胚龄越小，糖浓度要求越高。 确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后放入若干浓度的蔗糖溶液中，观察质壁分离现象，以确定等渗溶液的浓度。,附加物： a、氨基酸类，无论是单一的还是复合的AA都能
13、刺激胚的生长。最有效的是谷胺酰胺，常用的有甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。水解酪蛋白（CH）是一种AA复合物，有抑制早熟萌发和促进未成熟胚发育的作用 b、维生素类。维生素对初期幼胚一般是必需的，但有时也有抑制作用，最好在实验证实后使用。 c、天然提取物。常用各种胚乳汁、酵母提取物 d、生长调节剂, 环境条件 对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜，幼胚启动发育后给予和其自然光周期一致的光照条件有利于幼胚发育。 培养的温度 一般以该植物种子萌发的适宜温度为好。,培养材料 植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚培养有重要影响。 材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。 胚发育阶段以越幼嫩的胚越难以
14、培养。,二.子房培养(ovary culture) 子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。 授粉前子房培养是为了获得孤雌生殖的单倍体植株，适用于那些胚囊分离特别困难的植物； 授粉后子房培养适用于那些获得种子特别困难、胚分离不易操作的植物，以获得种子或果实或植株。,二、子房培养,定义：子房培养是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。,子房由子房壁和胚珠组成,子房 的 结 构,未授精子房,授精子房,性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）-胚状体或愈伤组织-单倍体植株； 体细胞（珠被、子房壁）-胚状体或愈伤组织-二倍体植株；,材料的选择 （1）品种间的差
15、异 （2）胚囊发育时期：以八核胚囊和成熟胚囊 期的子房培养具有较高的诱导频率。,单核胚囊 3个反足细胞（合点端N） 8核胚囊 1个中央细胞（中央2X1N） (7细胞胚囊) 2个助细胞（珠孔端N） 1个卵细胞（珠孔端N）,三次有丝分裂,胚囊发育过程：,2培养基 （1）基本培养基 不同培养基对于子房培养产生愈伤组织的诱导率有直接影响，比较常用的培养基是N6、BN、MS，禾本科作物以N6培养基较常用，其它植物则多用MS和BN。,（2）植物生长调节物质的影响 未授粉的子房培养必须加入适宜种类和浓度的植物生长调节物质。 百合未授粉子房培养 2,4 D 单独使用诱导频率为18.87% 2,4 - D6-B
16、A 诱导频率为33.73% 2,4 - DKT 诱导频率为47.76% 荞麦未授粉子房培养 2,4 D 单独使用诱导频率为7.6% 2,4 - DKT 诱导频率为1.8% KT：6-糠氨基嘌呤，激动素,（3）蔗糖浓度 蔗糖浓度多在310之间，因不同植物材料而异。 诱导培养阶段蔗糖浓度高。 分化培养时蔗糖浓度要低。 3.接种方式 主要考虑两个方面的问题： 极性；营养吸收,三.植物胚乳培养(endosperm culture),1概况 胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。胚乳培养的研究主要集中在以下一些问题的探讨： A、胚乳细胞的全能性 在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。,B、
