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1、第三章 免疫学检测技术,韶关学院生科院 易道生,内容,掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结合力和比例。 掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的选择与使用。 掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法。 掌握免疫印痕（Western blot）的技术原理与方法。 了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法。 目标： 掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法,免疫学检测技术就是利用抗原和抗体高度特异性结合的原理和方法，检测分析各样品中的目标物质，以监控物品质量、检测机体免疫机能和诊断某些疾病的体外检测方法。 免疫检测是微量检测方法，灵敏、特异。随着方法和
2、技术的改进，免疫检测方法已渗入工、农、食品、医药等各个领域。,从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。 本章主要学习血清学检测方法抗原抗体检测方法。,免疫学技术的发展史,第一节 免疫学检测的基本原理,抗原抗体反应指抗原与相应抗体间的特异性结合反应。曾叫血清学反应。,抗体结构,一、抗原抗体的特异性结合,抗原抗体的结合反应，在体内可介导溶细胞效应、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套机体体液免疫功能。 体外反应有凝集作
3、用、沉淀作用、调节作用、中和作用等。 1、抗原抗体的互补性和亲和性 抗原抗体的结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区分子间的互补性和亲和性。,互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。 亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗原表位间互相适应产生的吸引力。 互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab 间固有的作用力。 2、抗原抗体结合力 抗原和抗体分子的结合可以是游离形式的，也可以结合在细胞表面。这种结合也是非共价键结合。,抗原与抗体相互结合只局限于分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。由这些特定部位之
4、间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。 抗原抗体间的作用力有：,抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以下几种： 1、盐键（离子键） 2、范德华力 3、疏水作用 4、氢键,3、亲水胶转化为疏水胶 抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。一旦破坏电荷和水化层，如Ag + Ab，减少电荷，由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag Ab复合物沉淀。 利用此沉淀反应可检测相应的抗原或抗体。,二、抗原抗体反应的特点,1、特异性 抗原与抗体相互结合必须有
5、空间构型的互补性，因此，有很强的特异性。 但，如果两种抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗体间构型有部分或全部相同，就可能出现交叉结合凝集或沉淀。 既可能干扰实验，也可以用于扩大应用范围。,2、比例性 抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与反应物的量（浓度）有关。 比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应物浓度的关系。 只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生成可见的复合物。 在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和抗体。 滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物产生明显可见的反应所需的最小量。,抗原抗体反应的等价带（zone of equival
6、ence）：曲线的高峰部分，抗原抗体分子比例合适的范围。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。 最适比（optimal ratio）：其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适。 带现象（zone phenomenon）：等价带前后分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成。 前带（prezone）：抗体过量 后带（postzone）：抗原过剩。,抗原抗体比例对反应现象的影响,3、可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应。 Ag + Ab Ag-Ab 高亲和力抗原表位和抗体超变区的构型非常适合，结合牢固，不易解离。解离取决于： 抗
7、体对相应抗原的亲和力 环境因素对复合物的影响 当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。,4、阶段性 抗原抗体反应被人为分为2阶段。 结合阶段： 当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。 反应阶段：在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比
8、例。只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。,三、影响抗原抗体反应的因素,抗原抗体自身因素 抗原：理化性状 决定簇种类和数量 抗体： 来源： 兔等， 马、人 单克隆抗体 浓度 特异性和亲和力,2 环境因素 电解质 Na+和C1，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。 酸碱度 抗原抗体反应一般在pH为68进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。,温度 温度升高可加速分子运动，抗原
9、与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37。 适当振荡/搅拌 可促进抗原抗体分子的接触，加速反应,特异性,结合力的表示方法,亲和力和亲合力,Ag-Ab反应的原理,Ag-Ab反应的可见性,常见血清学检测 1.凝集反应,直接凝集反应,1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16,细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。,玻片法,试管法,常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定,常用于检测抗体的滴度或效价，见于临
10、床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。,间接凝集反应,将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：,+,病人的RBC,体内anti-Rh,由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集,+,Y,体外加入抗人IgG,出现凝集现象，叫直接库姆试验,正常人O型血的Rh+的RBC,+,患者血清内的游离anti-Rh,+,Y,体外加入抗人I
11、gG,出现凝集现象，叫间接库姆试验,2.沉淀反应,单向免疫扩散,双向免疫扩散,免疫比浊,过量Ab Ab Ab Ab,毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。,鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同,用于确定抗原浓度,沉淀反应免疫电泳,存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。,第二节 免疫组织化学检测技术,抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。 免疫组
12、织化学：用带标记物的抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应或组织化学反应，对相应抗或抗体进行定性、定量、定位测定的技术。,免疫组化分类 免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为： 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法 放射免疫自显影法 按标记抗体的方式分： 标记抗体IHCT法 非标记抗体IHCT法,非标记抗体IHCT法的二抗不被标记，用以免疫动物制备抗酶抗体，以酶-抗体再与二抗结合。 按染色步骤分： 直接法（一步法） 间接法（2步法或多步法）,一、检测原理 通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体(单克隆或多克隆)或抗原检测组织、细胞内相应的抗原或抗体物质，形成抗原 - 抗体复合物；
13、利用此复合物上带有预先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。 可作为抗原的物质有 酶、 受体、 抗体、 细胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体。,二、免疫标记物显色原理,免疫酶测定法 免疫荧光技术 放射免疫测定法 免疫胶体金技术,免疫酶测定法,夹心法ELISA 间接ELISA BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁 微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。,免疫组化技术,定位、
14、定性、定量检测,免疫荧光技术,海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触),培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色,放射免疫测定,用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。,化学发光免疫技术,将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。 灵敏度高、简便、可实现自动化分析。,免疫胶体金技术,用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗
15、粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。,免疫印迹法-Western blotting,三、标记抗体的特点与应用原理,1、一级抗体（第一抗体） 属识别系统，特异性识别来自样本的靶抗原。 常用单抗或多抗，实验前-20 -40保存（1-2年有效），应用液4约一周。一抗的使用浓度在不同实验中是不一样的，最佳用量需经预实验确定，一般选顶准阳性的稀释度。 2、二级抗体（第二抗体） 连接放大和酶标显色指示系统的抗体。属桥连抗体，一手连一抗，一手连标志物（酶），根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。,如要在实验中同时确定一抗、
16、二抗的浓度，最简单的是方阵（棋盘）滴定法。 3、非标志抗体IHCT和放大检测系统的应用原理 1）酶-抗酶法（PAP） 利用酶联抗体将酶与组织切片中抗原相结合，通过与适当底物反应（通常是H2O2）以及二氨基联苯胺(diaminobenzidine DAB)的显色剂，产生一种不溶性棕色反应产物。该法已被进一步改进发展为更敏感的多级桥联法，后者利于增加在抗原部位反应产物的沉积。,PAP法是酶-酶抗体(PAP)复合物（常用辣根过氧化物酶）组成的可溶性复合物为五环状结构，3个分子辣根过氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫荧光法敏感100-1000倍，比酶桥法敏感20倍，其原理是特异性初级抗体（一抗）的Fab段与组织抗原结合，二抗（桥抗）在一抗与PAP复合物之间形成分子桥联（此时一抗与PAP中的免疫球蛋必须是同一种属，以使得衍生自其它种属的二抗，对一抗分子PAP中的FC
