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1、2019/1/14,1,第三章 灭菌技术 【本章学习的目的和要求】 1.了解培养基灭菌的原理；了解发酵培养液的无菌检查方法；了解空气除菌的原理。 2.熟悉空气过滤除菌的流程和常见设备无菌。 3.掌握常用的灭菌方法和原理；掌握培养基分批灭菌和连续灭菌的操作流程；掌握发酵用空气的质量标准。,2019/1/14,2,第一节 灭菌 灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中一切有生命的有机体的技术或工艺过程。 一、常用灭菌方法的基本原理 （一）化学物质（药剂）灭菌 化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。 常用的化学药剂介绍如下：,2019/1/14,3,1乙醇 70%-
2、75%乙醇溶液杀菌作用最强 2甲醛 将甲醛溶液（37%）直接加热，按18ml/m3计算用量 3新洁而灭 0.25%的溶液 4石炭酸3%-5%的水溶液 (二)辐射灭菌 紫外线波长在240-300nm范围内 （三）干热灭菌 一般要求160-170，保温1-2h,。,2019/1/14,4,表4-1 干热灭菌所需温度和时间,2019/1/14,5,(四)湿热灭菌 一般的湿热灭菌条件为121，30min （五）过滤除菌 二、培养基的灭菌 目前在工业生产中培养基的灭菌通常采用湿热灭菌法，包括实罐灭菌（实消）、连续灭菌（连消）两种方法,2019/1/14,6,表4-2 不同灭菌条件下对培养基营养成分破坏的
3、情况,2019/1/14,7,（一）微生物的死亡速率与理论灭菌时间 1微生物的热阻 致死温度:杀死微生物的极限温度。 致死时间:在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成。 在致死温度以上，温度越高，致死时间越短。,2019/1/14,8,热阻:是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。 表4-3 微生物对湿热的相对抵抗力,2019/1/14,9,表4-4 在不同温度下的湿热灭菌杀死芽孢所需要的时间,2019/1/14,10,2微生物的热死规律对数残留定律 微生物热死是指微生物受热失活直到
4、死亡。微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固变性所致。 在培养基进行湿热灭菌时，微生物受热后，其死亡细胞的个数变化与化学法反应的浓度变化一样，遵循一定的规律，培养基中的微生物受热死亡的速率与任一瞬间残存的微生物数量成正比，这就是“对数残留定律”，用下式表示： dN/dt= - kN （4-1） 式中 N培养基中残存活菌数 t 受热时间，min k 反应速率常数(又称比死亡速率常数)，min-1；与灭菌温度、菌种特性有关,2019/1/14,11,Nt=N0e-kt 式中N0灭菌开始时原有的菌数，个； Nt 灭菌结束时残留的菌数，个。 根据上述的对数残留方程式，如果要求达到彻底灭菌，
5、即Nt=0,则所需的灭菌时间t为无限长，这在实际生产中是不可行的，因此实际设计时，常采用Nt=0.001（即在1000批次灭菌中只有1批是失败的）。如以残留菌数的对数与灭菌时间t的实测数在半对数坐标纸上绘图，得出的残留曲线为一直线其斜率的绝对值为比死亡速率常数k。,2019/1/14,12,4-5表121下，不同细菌芽孢的k值,2019/1/14,13,（二）培养基的分批灭菌（实罐灭菌、实消） 1培养基预热 灭菌时，培养基需要先加热到80-90，然后再导入蒸汽升温到120-130进行灭菌。预热的方法是：先将各排气阀门打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升到80-90，将排气阀门逐渐关小。
6、 预热的目的：一是防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温差过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释，二是防止直接导入蒸汽容易造成泡沫急剧上升而引起物料外溢。,2019/1/14,14,2培养基灭菌 当罐温升到80-90时，将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接导入罐内、使罐温上升到120-130，保温30min。 灭菌时应注意：各路蒸汽进口要畅通，防止逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度；排气量不宜过大，以节约蒸汽用量。,2019/1/14,15,2019/1/14,16,3冷却 待灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后打开夹套或蛇管冷却水冷却，以避免罐压迅速下降，产生负
7、压而抽吸外界空气。 注意：在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基（或物料）将倒流入过滤器内。,2019/1/14,17,（三）培养基的连续灭菌（连消）,2019/1/14,18,1连续灭菌工艺的特点 （1）在较高的温度和较短的时间内灭菌，营养成分破坏的少； （2）发酵罐非生产占用时间缩短，容积利用率提高； （3）热能利用合理，适于实现自动化控制； （4）不适用于粘度大或固形物含量高的培养基灭菌； （5）增加了一套连续灭菌装置，操作环节增多，从而增加了染菌的机率。,2019/1/14,19,2连续灭菌操作步骤 （1）配料 （2）培养基预热 在预热桶内，一般可先将培养基预热到70
8、-90。 （3）加热使料液温度在较短的时间（20-30s）内迅速达到灭菌温度，连续灭菌的温度一般以126-132为宜，加热采用的蒸汽压力一般为4.5-8105Pa，加热器有塔式和喷射式两种。,2019/1/14,20,（4）保温（维持）,图3 维持罐结构,2019/1/14,21,（5）降温 （40-45）,图4 喷淋冷却器,2019/1/14,22,三、空罐灭菌与发酵附属设备及管路的灭菌 （一）空罐灭菌（空消） 空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.5105-2.0105Pa、罐温为125-130、时间为30-45min。灭菌时要求总蒸汽压力不低于3.0105-3.5105Pa
9、、使用压力不低于2.5105-3.0105Pa。,2019/1/14,23,（二）发酵附属设备的灭菌 发酵附属设备有总（分）空气过滤器、管道、计量罐、补料罐、消沫系统等。 1.糖水罐的灭菌 一般糖水罐灭菌时罐压为1105 Pa，保温时间为30min。 2.油（消沫剂）罐的灭菌 油（消沫剂）罐灭菌时的罐压为1.5105-1.8105 Pa，保温时间为60min。 3.总（分）空气过滤器的灭菌 维持压力1.74105 Pa，灭菌时间2h。 4.管道的灭菌 管道灭菌时的蒸汽压力不应低于3.4105Pa，保温时间为1h。,2019/1/14,24,第二节 空气除菌 一、空气的过滤除菌 （一）空气过滤除
10、菌的原理 1绝对过滤 绝对过滤所用介质的孔隙小于营养细胞和孢子，能将微生物阻留在介质的一侧，从而获得无菌空气。如用聚四氟乙烯或者纤维素酯材料做成的微孔滤膜（孔径在0.22m）。 2深层介质过滤,2019/1/14,25,深层介质过滤所用介质(如棉花、玻璃纤维等)孔隙大于微生物，例如，空气中微粒的直径dp一般为0.5-10m，而作为过滤介质的棉花纤维直径dt在16-20m，玻璃纤维直径dt在5-19m，同时，纤维之间存在着较大空隙，（在50m左右），那么纤维是如何捕集空气中的微生物粒子呢？,2019/1/14,26,主要有以下几种机理： 微粒随气流通过滤层时，过滤层具有一定的厚度，滤层纤维所形成
11、的网格阻碍气流前进，迫使气体在流动过程中产生无数次改变气流速度大小和方向的绕流运动，这些改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击、重力沉降、拦截、布郎扩散、静电吸附等作用而将微粒滞留在纤维表面。同时因为滤层是由无数单纤维层组成，所以就增加了捕获微粒的机会。,2019/1/14,27,图4-6 除去液滴或颗粒的纤维工作原理,图4-6 除去液滴或颗粒的纤维工作原理 在上述五种除菌机制中，截留和静电吸附作用不受外界影响，而其他三种机制遇空气流速直接相关。一般认为惯性冲击、拦截、布朗扩散截流的作用较大，如图4-6所示。而重力沉降和静电吸附的作用较小，但最终的结果是几种作用的综合效应。,2019/1/14,2
12、8,（二）空气过滤介质 常用的过滤介质有棉花（未脱脂）、颗粒状活性炭、玻璃纤维、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、烧结材料。 常用的滤膜有：新型绝对过滤介质可耐蒸汽灭菌的膜材料PVDF（聚偏氟乙烯）和PTFE（聚四氟乙烯）以及尼龙膜等，增加了灭菌效果。,2019/1/14,29,（三）空气过滤器 表4-6几种过滤器的适用条件及性能比较,2019/1/14,30,二、发酵用空气的质量标准 生物浓度104个/m3作为空气的污染指标 发酵用无菌空气，就是将自然界的空气经过压缩、冷却、减湿、过滤等过程，达到以下标准： 1连续提供一定流量的压缩空气。 2空气的压强（表压）为2105-4105Pa，压强过低不利于
13、克服发酵罐中的下游阻力，压强过高，则是浪费能源。 3空气在进入过滤器前，相对湿度70%。这是为了防止空气过滤器过滤介质受潮，影响过滤效果。,2019/1/14,31,4进入发酵罐的空气温度可以比培养温度高10-30。 5压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般指标取失败概率为10-3，也可以把100级作为无菌空气的洁净指标。100级指每立方米空气中，尘埃粒子数最大允许值0.5m的为3500个/m3，尘埃粒子数最大允许值5m的为0个/m3；微生物最大允许值为5个浮游菌，1个沉降菌/m3。,2019/1/14,32,2019/1/14,33,一般把这个流程中空气进入空气过滤器以前的部分称为空气预
14、处理阶段。下面我们将预处理阶段的设备简单介绍如下： 1采风塔 采风塔应建在工厂的上风口，远离烟囱。采风塔越高越好，至少10m，设计气流速度8m/s左右 2粗过滤器 过滤介质可采用泡沫塑料（平板式）或者无纺布（折叠式），设计流速为0.1-0.5m/s。 3空气压缩机,2019/1/14,34,4空气贮罐 5冷却器 6汽液分离设备 （1）旋风分离器 旋风分离器是利用离心力沉降进行汽-液或汽-固沉降分离的设备。主要除去空气中较大的雾滴（油、水），可以除去空气中绝大多数的20m以上的液滴。 （2）丝网除沫（分离）器 丝网分离器是利用惯性拦截的原理来进行汽液分离的设备。主要分离空气中较小的雾滴（1m以上
15、），去除率约为98%。 7空气加热设备,2019/1/14,35,2019/1/14,36,2019/1/14,37,1、 高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程,特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到3035，第二级冷却至2025，经分水后加热到3035，因为温度升高，相对湿度下降。,2019/1/14,38,2、冷热空气直接混合式空气除菌流程,特点 ：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为3035，相对湿度为
16、5060%。,2019/1/14,39,2019/1/14,40,2019/1/14,41,第三节 无菌检查及发酵废气废物的安全处理 一、无菌检查 （一）无菌试验 1肉汤培养法 2双碟法 3斜面培养法 （二）显微镜检查（镜检） （三）试剂盒检查,2019/1/14,42,二、发酵废气、废物的安全处理 发生噬菌体污染后，虽经碱液处理，吸风口空气中尚有噬菌体的存在，这些噬菌体单靠过滤很难除去。利用噬菌体对热的耐受力差的特点，在空气预处理过程中，将贮罐紧靠着空压机。此时的空气温度很高，空气在贮罐中停留一段时间可达到杀灭噬菌体的作用。 一旦发生发酵液污染，发酵液需要经过处理方可排放，否则造成新的污染源。一般是直接通入蒸汽灭菌处理，也可假如甲醛再用湿热灭菌处理。,2019/1/14,43,【本章小结】 本章在介绍灭菌技术的原理和方法的基础上，重点阐述了发酵培养基与发酵设备的灭菌、空气过滤除菌的流程和方
