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1、第三章 细胞融合与单克隆抗体,3.1 细胞融合(cell fusion),定义:在离体条件下用人工的方法把不同种的细胞通过无 性方式融合成一个杂合细胞的技术。,3.1.1细胞融合的发展历史,“自发”细胞融合现象：,1838年 Muller 多核的肿瘤细胞,1858年 Virchow 正常组织、发炎组织及肿 瘤组织多核细胞,1873年 Luginbuhl 天花病人多核体血细胞,1875年 Lange 蛙类血液细胞发生合并,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1 细胞融合(cell fusion),3.1 细胞融合(cell fusion),重要事件,1962年,(日)冈田善雄 仙台病
2、毒促细胞融合,70年代,(华裔加籍)高国楠 PEG促植物原生 质体的融合,80年代，电融合,3.1 细胞融合(cell fusion),植物细胞融合：,1972年（美）P.S.Carlson杂种烟草,现代植物细胞融合的开始,1978年（德）梅歇尔斯“pomoto”,3.1 细胞融合(cell fusion),“Pomoto ”,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1.2 植物原生质体培养与细胞融合 (Protoplast and Cell fusion),植物原生质体培养 植物细胞融合,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1.3 动物细胞融合,动物细胞融合是研究细胞遗传
3、信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。,3.1 细胞融合(cell fusion),肿瘤细胞与树突状细胞的融合,3.1 细胞融合(cell fusion),人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合,1978年,(瑞士)埃勒门斯,(美国)柯路斯,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1 细胞融合(cell fusion),3.1.4 细胞融合的诱导,诱导融合的方法:,物理法:电场刺激 激光 显微操作,化学法:聚乙二醇(PEG)结合高pH、 高钙离子法,生物法:仙台病毒,3.1 细胞融合(cell fusion),不同细胞融合的条件及其主要应用,3.1 细胞融合(cell
4、fusion),仙台病毒诱导,仙台病毒(Sendal virus),也称日本血凝病毒HVJ，属粘病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。,3.1 细胞融合(cell fusion),融合的可能机制：,病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。,3.1 细胞融合(cell fusion),融合过程：,1. 病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞 粘着成堆，在4冰浴中细胞紧密靠近，但不 发生融合。 2. 37 温浴后，粘结
5、部位的细胞膜破坏，形成 通道，细胞质流通、融汇。 3. 病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、 变圆，完成融合，全过程约1530分钟。 4. 细胞核也相互合并,完成细胞融合,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1 细胞融合(cell fusion),PEG诱导,PEG聚乙二醇(polyethylene glycol),商品名：卡波蜡(carbowax),多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH,实验室用PEG平均分子量在20020,000 一般：1,000固体 常用分子量：40006000,3.1 细胞融合(cell fusion),融合的可能机制,？脱水作用能使细胞凝聚，并使
6、膜结构发生 变化,？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之 故。,？,3.1 细胞融合(cell fusion),初步分析,可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,3.1 细胞融合(cell fusion),PEG诱导过程注意事项：,控制与分子量、浓度和处理时间,悬浮法：将细胞悬于4050的PEG4000进行 溶
7、，处理12分钟为宜。,离心法：先将细胞混合物悬于3040的 PEG4000，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以58分钟为宜。,3.1 细胞融合(cell fusion),PEG诱导注意事项：,pH值以pH7.48.0为宜，或略偏碱性pH8.08.2。,辅以515的DMSO或在融合前用PHA处理一下，效 果更好。,3.1 细胞融合(cell fusion),PEG融合法优点,效率高 材料方便，操作简易 效果稳定,PEG融合法缺点,对细胞有毒性,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1 细胞融合(cell fusion),物理电融合诱导,机制,在直流电脉冲的诱导下, 原生质体质膜
8、表面的电荷和氧化还原电位变化, 使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体,3.1 细胞融合(cell fusion),电融合诱导法原理示意图,3.1 细胞融合(cell fusion),电融合优点：,融合效率高，可达5080,产生杂交细胞的频率高，是PEG法的100倍。,操作简便、稳定，但需设备。,对细胞无毒害作用。,可在显微镜下观察操作。,3.1 细胞融合(cell fusion),融合率,融合细胞的细胞核总数,视野内全部细胞的细胞核总数,100,融合率=,3.1 细胞融合(cell fusion),植物细胞融合基本过程,去除细胞壁以获得大量的原生质体
9、诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合 筛选,培养,促进细胞分裂,分化, 从细胞团,愈伤组织到最后成株,3.1 细胞融合(cell fusion),动物细胞融合基本过程,动物单个细胞的获得,组织的获得,组织的消化,诱导细胞融合形成杂种细胞,筛选，培养,3.1 细胞融合(cell fusion),3.1 细胞融合(cell fusion),植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,3.1 细胞融合(cell fusion),影响细胞融合的因素,(1) 亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融 合；表面光滑者较难融合。,(2) 细胞种类不同，融合效果
10、不同，如腹水癌及株化细胞较易 融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。,(3) 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧 利希氏腹水癌细胞融合时，于37 振摇时易于融合，且 融合效率与病毒量呈正比。但在34 振摇则融合率下降。 在37时不振摇则几乎不融合。,影响细胞融合的因素,3.1 细胞融合(cell fusion),(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。,(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生 变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替 Ca2+但有效浓
11、度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度 一般为0.1mol/L,(6)最适合的pH为7478之间，在此范围之外，融合率均较 低。,3.1 细胞融合(cell fusion),融合细胞的特征及其意义,染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失,3.1 细胞融合(cell fusion),理论研究基因定位和绘制基因图工作中十分有用 应用价值单克隆抗体 植物育种,3.1 细胞融合(cell fusion),融合细胞类型,同核体（homokaryon）,异核体(heterokaryon）,多核体（polykaryon）,异胞质体(heterocybrid),3.1 细胞融合(ce
12、ll fusion),同核体(homokaryon),同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。,3.1 细胞融合(cell fusion),异核体(heterokaryon),非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。,3.1 细胞融合(cell fusion),多核体(polykaryon),含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。,3.1 细胞融合(cell fusion),异胞质体(heterocybrid),不同胞质来源。用射线或细胞松弛素B处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。,3.1 细胞融合(cell fusion),杂种细胞筛选方法,（1）遗传互补筛选法 （2）抗性互补筛选法 （3）生长特性筛选法 （4）物理特性筛选法,3.1 细胞融合(cell fusion),
