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1、分子克隆常用载体,质粒载体 噬菌体载体 柯斯载体 酵母细胞的克隆载体,一、质粒载体,理想的质粒载体必须具备的基本条件,1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因 3、具有若干限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较多的拷贝数,重要的大肠杆菌质粒载体,pSC101质粒载体； ColE 1质粒载体； pBR322质粒载体； pUC质粒载体； T载体,pUCm-T质粒图谱,pUCm-T载体序列,二、噬菌体载体,噬菌体的生命周期,（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体） （2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）,（1）烈性噬菌体的生活周期,（2）温和噬菌体的生活周期,裂解循环,溶源态,重要的噬菌体载体,
2、一、噬菌体载体 （1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入,（2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代,噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 36kb 51kb。,体外包装：噬菌体载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白,头部基因 （琥珀突变型）,尾部基因 （琥珀突变型）,转录复制 蛋白质合成,组装尾部所需要的组分,“无头部”的提取物,组装头部所需要的组分,“无尾部”的提取物,温育,转录复制 蛋白质合成,体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的
3、效率高100-10000倍,sup-细菌,完整的噬菌体,二、M13噬菌体载体,M13是丝状噬菌体，有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组。M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌。不过M13噬菌体DNA亦可通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞。,1.M13噬菌体作为载体优越性,（1）单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA。 （2）不论是RF DNA还是ss DNA，它们都能转染感受态的大肠杆菌寄主细胞。 （3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小制约的，因此不存在包装限制问题。 （4）可产生大量纯化的含外源片断的单链D
4、NA分子。,2.M13载体筛选方法,3.M13噬菌体载体的优点,与其它载体相比，M13载体具有两个十分有用的优点： 这类载体的基因组中有一条饰变的-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列。 M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克隆双链DNA分子的每一条链。,三、柯斯质粒载体,1.柯斯载体的组成 由质粒和粘性末端“尾巴”两部分组成。,2、Cosmid载体特点：,（1）具有噬菌体的特性（但因不含噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）； （2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7
5、kb, 克隆极限可达45kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。,四、酵母细胞的克隆载体,1、整合型载体（YIP） YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。这类载体在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析工作。,2、复制型载体（YRP）,YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制 可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体，穿梭载体在基因工程中广泛使用。,Thanks!,
