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1、,第八章 高效液相色谱法,高效液相色谱法,第一节 高效液相色谱法简介 第二节 高效液相色谱的类型 第三节 高效液相色谱仪 第四节 高效液相色谱固定相 第五节 液相色谱流动相 第六节 高效液相色谱检测器,第八章 高效液相色谱法,第一节,高效液相色谱法简介,高效液相色谱法是19641965年开始发展起来的一项新颖快速的分离分析技术。 它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器后，发展成为高分离速度、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法。也称现代液相色谱法。,概述：,共同点： 高效液相色谱是在气相色谱高速发展的情况下发展起来的，它们之间在
2、理论上和技术上有许多共同点。 （1）色谱的基本理论是一致的； （2）定性定量原理完全一样； （3）均可应用计算机控制色谱操作条件和色谱数据的处理程序，自动化程度高。,液相色谱和气相色谱的异同点：,1.流动相差别 2.固定相差别 3.使用范围更广 4.在原理和结构方面有差异,因液相色谱的流动相是液体，其粘度比气体大100倍以上，扩散系数比气体小102105倍；因此溶质分子与液体流动相之间的作用力不能忽略，致使液相色谱与气相色谱有以下的差别：,二者的差异：,液相与气相差异,流动相：气相色谱为气体、液相色谱为液体。 以液体作流动相，液体分子与样品分子间的作用力不能忽略；液体种类多，性质差别大，水溶液
3、或有机溶剂，极性或非极性化合物，可供选择的范围广。是控制柱效和分离效率的重要因素之一。 使高效液相色谱除了固定相的选择外，增加了一个可供选择的重要的操作参数。,液相与气相差异,1.流动相差别,气相色谱固定相多为固体吸附剂或在担体表面上涂渍一层高沸点有机液体而成的液体固定相、近年才出现一些化学键合相，粒度粗(100250m)，吸附等温线多是非线性的，成本较低。 高效液相色谱固定相大都是新型的固体吸附剂或化学键合相，粒度小(310m)，分配等温线多是线性的，峰形对称，成本较高，发现容量大，分析型色谱柱最大容量可达50mg以上。,液相与气相差异,2.固定相差别,气相色谱分析是沸点在500以下、分子量
4、少于450的物质。对热稳定性差、易于分解变质，或具有生理活性的物质，都不能用升温气化的方法分析。气相色谱只能分析约占有机物总数15%20%的物质。 高效液相色谱在室温或接近室温条件下工作，可分析沸点在500以上、分子量450以上的有机物质，约占总数的80%85%。高效液相色谱的使用范围远远超过气相色谱。,液相与气相差异,3.使用范围广,高压液相色谱仪具有高压输液泵和输液系统，其检测器的检测原理和结构与气相色谱也有较大差异。 高效液相色谱和气相色谱在功能方面各有所长、相互补充。 在高效液相色谱广泛应用的同时，气相色谱仍然发挥着它的重要作用。,液相与气相差异,4. 在原理和结构方面的不同,一、液液
5、色谱法， 二、液固色谱法， 三、离子交换色谱法 四、排阻色谱。,第二节 高效液相色谱的类型,一、液液色谱法, 涂渍固定相，将某些固定液涂渍在惰性担体的表面；涂渍的固定相，固定液易于流失，柱子寿命短，分离的重现性和分离效果好，是目前固定相的发展方向。 化学键合固定相，把化学基团与惰性担体反应，使其以共价键的形式结合在担体表面上。柱子性质稳定、寿命长。,又称液液分配色谱。,1、液液色谱固定相的形式，两种：,不同溶质在两个液相中，有不同的分配系数。化学键合相的液液色谱，分配机理和吸附机理同时存在。为了防止色谱分离过程中两相的混溶，流动相与固定相的极性必须不同。,2、分离原理,当固定相为极性时，流动相
6、为非极性溶剂，此时组分流出先后的顺序是非极性向极性过度，称为正相色谱。 固定相为非极性，用极性溶剂作流动相，组分的流出顺序是极性组分先流出，称为反相色谱。,3、正相色谱和反相色谱,固定相与正相色谱或反相色谱相同，流动相是含有适当有机反离子的溶剂，它能与组分生成离子对，称为正相离子对色谱或反相离子对色谱。离子对色谱，可以分析离子型或可离解的化合物。,4、液液色谱的一种特殊形式 离子对色谱,二、液固色谱,也称液固吸附色谱,1、固定相：以固体吸附剂如硅胶，各种微球硅珠，氧化镁，氧化铝，活性炭，聚酰胺等作为固定相。吸附剂粒度约2050m或3575m左右，比液液色谱固定相(310m)的粒度大。,2、分离
7、原理：吸附剂表面与溶质分子中功能团的吸附与解吸作用，是溶质分子与溶剂分子对固定相的竞争吸附的能力差异。 溶剂的极性强弱对分离和分析速度影响很大，液固色谱主要用来分析具有极性官能团、且极性不太强的化合物。,吸附剂对同系物的选择分离能力小，对不同族化合物的选择分离能力强。主要用于按族分离化合物。 溶质分子在吸附剂活性中心上的吸附能力与分子的几何形状有关，液固色谱对异构体有高的选择性，能分离几何异构体(顺反异构体)和同分异构体(不同取代位)。 缺点:重复性差。对流动相的含水量须严格控制，方能获得有重复性的保留值。每次分析后，特别是作梯度洗脱时，色谱柱再生的时间很长，耗费溶剂多。,3、液固色谱分离特点
8、,三、离子交换色谱,1、固定相：为带有电荷官能团的离子交换剂，并存在带相同电荷数的相反离子反离子。根据分离离子的不同而采用阳离子交换剂(-SO3-等基团)或阴离子交换剂(-N(CH3)3+等)。,2、机理： 流动相中被分析的离子与反离子之间发生竞争吸附。根据吸附能力不同将物质分离。,离子交换色谱主要用于分离能解离为离子的化合物，如无机离子、核酸、氨基酸等。,交换剂R+的反离子Y-是阴离子的为阴离子交换色谱。交换剂R-带负电荷，其反离子Y+为阳离子的称为阳离子交换色谱。,离子交换色谱的吸附示意,四、凝胶色谱 也称排阻色谱、空间排阻色谱等。凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。,1、
9、固定相：凝胶。是一种表面惰性，含有许多不同尺寸孔穴或立体网状结构的物质。凝胶的孔穴大小应与被分离组分的大小基本相当。,2、分离原理：当试样随流动相在凝胶外的间隙和凝胶空穴中流动时，分子体积大的不能渗透到凝胶孔穴中去，随流动相快速流出。中等大小的分子，能选择性地渗透到部分孔穴中去，流出稍慢。分子体积小的，则渗透到凝胶内部的孔穴深处中，移出困难，被冲洗出来的速度慢。 分子越小，在孔穴的渗透越深，流出越慢。这样，各组分按分子大小先后从柱中流出。,3、应用：凝胶色谱主要是分离和鉴定高分子量的化合物。对于分子量高达150000000的特大分子的混合物也可进行分离和鉴定。 凝胶颗粒的微孔直径大小可根据分析
10、的要求加以选择。其孔径的线性范围不同，可以用于分离不同分子量范围的组分。 凝胶色谱在生物样品(蛋白质、酶、核酸等)与高分子化合物的化学分析中有重要的应用价值。,第三节 高效液相色谱仪,现代高效液相色谱仪，在复杂程度及各种部件的功能上都有很大的差别。仪器的基本结构可分为：液相输送系统，进样系统，色谱分离系统与检测记录数据处理系统等四部分。,液相色谱仪的结构示意图,一、液相输送系统 液相输送系统包括：贮液槽、高压泵，有的还配备有梯度洗脱装置。,1、贮液槽：贮存流动相，容量为0.51L。 流动相必须脱气，除去溶解在流动相中的空气，以防止溶解的空气在检测池内形成气泡，引起基线漂移，或不规则的噪音。 脱
11、气的方法：(1)超声波振动脱气，(2)加热沸腾回流脱气 (3)真空脱气。,高压输液泵的作用是输送恒定流量的流动相。按输液特性可分为：恒流泵和恒压泵。 (1)恒流泵 主要优点是始终输送恒定流量的液体，与柱压力的大小和压力的变化无关。因此，保留值的重复性好，基线稳定，能满足高精度分析和梯度洗脱的要求。,2. 高压输液泵,恒流泵的主要类型为：柱塞式往复泵。 该泵的主要优点：输液连续，流速与色谱系统的压力无关，泵室的体积很小(几微升到几十微升)。适用于梯度洗脱和再循环洗脱，清洗方便，更换溶剂容易。 缺点：输送有脉动的液流，液流不稳定，引起基线噪声。克服的方法是在泵和色谱柱间串入一根盘状阻尼管，使液流平
12、稳。,恒压泵通过采用适当的气动装置，使高压惰性气体直接加压于流动相，输出无脉动的液流。也称为气动泵。这种泵简单价廉，但流速不如恒流泵精确稳定。只适用于对流速精度要求不高的分析或作为装填色谱柱用泵。 恒压泵的优点：容易获得高压，没有脉冲，流速范围大。 缺点：受系统压力变化的影响大，保留值重复性较差，不适于梯度洗脱操作。泵体积较大，更换溶剂麻烦、耗费量大 。,（2）恒压泵,洗脱装置有两种工作方式： 一种是以两台或多台高压泵将不同的溶剂吸入混合室，在高压下混合，然后进入色谱柱。优点是通过电子器件分别程序控制两台或多台输液泵的流量，就可以获得任何一种形式的淋洗浓度曲线。缺点混合多种溶剂，需要多台高压泵
13、。 另一种是以一台高压泵通过多路电磁阀控制各路吸入的流量,同时吸入几种溶剂，经混合后送到色谱柱，这样只要一台高压泵。,3.梯度洗脱装置,指在分离过程中，随时间函数程序的改变，流动相的组成也逐渐改变，即流动相的强度(极性，pH，离子强度等)逐渐改变。,包括：进样口、注射器、六通阀和定量管等。它的作用是把样品有效的送入色谱柱中。 进样系统是柱外效应的重要来源之一，为了减少对板高的影响，避免由柱外效应而引起峰展宽，对进样口要求死体积小，没有死角，能够使样品象塞子一样进入色谱柱。,二、 进样系统,包括：色谱柱，柱温箱和连接阀等。 色谱柱 色谱柱包括柱管和固定相两部分。柱材料要求耐高温，内壁光滑，管内径
14、均匀，无条纹或微孔等；最常用的是不锈钢管。 柱温箱 柱温是液相色谱的重要操作参数。在较高的柱温下操作的优点：1.能增加样品在流动相中的溶解度，缩短分析时间，柱温升高6，组分保留时间约减少30%；2.减少传质阻力，增加柱效；3.降低流动相粘度，在相同流量下，降低柱压。 液相色谱常用柱温范围为室温65。,三、 色谱分离系统,四、检测记录数据系统,包括：检测器、记录仪和微型数据处理机。,常用的检测器为：示差折光检测器，紫外吸收检测器，荧光检测器，二极管阵列检测器等。 记录和数据处理系统与气相色谱仪相同。,一、液-固色谱固定相 二、 液液色谱固定相 三、 离子交换剂固定相 四、凝胶色谱固定相,第四节
15、高效液相色谱固定相,是以硅胶为基体的各种类型的硅珠。主要有全多孔微粒型硅珠、多孔层硅珠和堆积型硅珠。 1、全多孔硅珠，最初使用的是粒度3070m的全多孔硅珠，比表面积大约100400m2/g。 优点：孔径大而深，粒度大，易于装柱；比表面积大、柱容量大，允许较大进样量；制作工艺简单，成本也低。 缺点：孔径深，传质阻力大，柱效不高。 现在多用粒度为510m的全多孔微粒型硅珠，在柱效或柱容量方面都有大大提高。,一、液-固色谱固定相,2、多孔层硅珠： 也称表面多孔硅珠或薄壳硅珠。它是在粒度为3050m的硅珠表面上，覆盖一层多孔性基质，厚度为12m。 优点：孔浅，传质阻力小，柱效较高；流动性好，可用于干
16、法装柱。 缺点：比表面积小，只有120m2/g，样品容量小，易发生过载现象。只适用于高灵敏度检测器。,液-固色谱固定相,3、堆积型硅珠：将颗粒极细的硅珠经一定工艺，凝聚成510m的堆积硅珠。 优点：粒度分布窄、粒径接近，比表面积大，柱渗透性小，柱效高，压力低。 缺点：制造工艺复杂，价格昂贵。 微粒型全多孔硅珠和堆积型硅珠具有传质快，柱效高，容量大的优点，已成为液固色谱常用的固定相，普遍取代了多孔层硅珠。,液-固色谱固定相,不同土壤，不同磷源,30,m,m,二、 液液色谱固定相,主要为化学键合固定相。以硅珠为基质，利用硅珠表面的硅醇基团与键合基反应加工而成。 优点是： 1、在表面键合了有机物基团，消除了表面的吸附活性点，使表面更均一。 2、可以通过改变键合不同的有机分子基团来改变选择性。 3. 柱效高，固定液不流失，提高了柱子的稳定性和使用寿命。 4.由于牢固的化学键，能耐各种溶剂，有利于梯度淋洗和样品的回收。,三、 离子交换剂固
