培养基灭菌与空气净化

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1、第四章 灭菌与空气净化,灭菌是十分重要的工序，包括培养基、发酵设备及局部空间的彻底灭菌、通入空气的净化除菌。,第一节 灭菌方法及工业用培养基的灭菌,控制有害微生物主要有以下几种措施,消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭 或清除病原微生物（pathogen），达到无害化 程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽 孢体。,灭菌（sterilization）,灭菌（sterilization）：是指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程，达到无活微生物存在的过程。,一、灭菌的方法,常用的灭菌方法主要有化学灭菌、物理灭菌两类。 1、化学灭菌 化学灭菌是指

2、用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。常用化学灭菌剂有氧化剂类如高锰酸钾、过氧化氢等，卤化物类如漂白粉、氯气等，有机化合物如7075乙醇、甲醛、戊二醛、环氧乙烷、2新洁尔灭、3%5石炭酸等。使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。化学灭菌主要适合用于皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及局部空间或某些器械的消毒。,（1）干热灭菌 在高温120以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，生物体死亡。对于干热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都可以杀灭生物体。干热灭菌效果没有湿热灭菌好，是实验室常用的器皿的方法。工业采用160、2h，

3、或170、1h干热空气，,2、物理灭菌：包括使用各种物理条件如高温、 辐射、超声波及过滤等进行灭菌，效果好， 操作方便，广泛使用。,（2）火焰灭菌法 常用于接种工具如接种针、接种环等的灭菌。 （3）辐射灭菌 各种物理射线对生物细胞具有杀伤能力，其中以紫外线最常用。原理在于核酸和蛋白质在紫外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞死亡。但紫外线穿透力极低，只适宜于表面灭菌，常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、超净工作台等的灭菌。,（4）蒸汽湿热灭菌 湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下，蒸汽穿透力强，蒸汽冷

4、凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体死亡。 由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，操作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭菌。常用条件为115121，压力1105Pa，维持15-30分钟。,二、湿热灭菌方法,1、常压法 （1）巴氏消毒法（pasteurization）： 用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。 巴氏消毒法有2种： 低温维持法：在63下保持30分钟可进行牛奶消毒； 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72下保持15秒钟即可

5、。,（2）间歇灭菌法 又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。 方法是：将待灭菌的培养基在80-100下蒸煮15-60分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。,2、加压法,（1）常规加压灭菌法 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽冷空气后将锅密闭，再继续加热至121，时间维持15-30分钟。 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。,（2）连续加压灭菌法,在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模

6、的发酵工厂中作培养基灭菌用。 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135140下处理515秒钟。,三、理论灭菌时间,微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：,-dN/dt = k * N,-dN/dt = k * N（杂菌死亡的一级动力学方程） 式中dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数 K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数， K=f(灭菌温度、菌种、培

7、养基等) 上式的积分形式为： t = 2.303/k * lnN0/Nt 此式为对数残留定律，式中N0，Nt： 分别表示灭 菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）， t ：表示理论灭菌时间,理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：,（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大（愈耐热），K值也越小；灭菌温度愈高， K值愈大。 例如：芽孢，在121时，K=60/s 营养体，在121，k=60-6*1010/s,(2)在计算过程中，N0，Nt如何取值？ N0 = 芽孢性细菌总数 + 芽孢数 灭菌时温度升高，营

8、养体即可变成芽孢。 对于 Nt ，如果取Nt = 0，那么，t = ，这显然是与现实情况不符。 通常取Nt = 10-3，这个数值如何理解？灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。,（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，因此在实际生产中，通常采用经验数值： 间歇灭菌，121，20-30分钟,（四）培养基灭菌温度的选择,1、灭菌温度的选择应考虑的因素主要有： a.

9、灭菌温度应高于微生物的热致死温度。何为热致死温度？（10分钟，全部死亡的温度） b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程 因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。,许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度： dc/dt = - KC（营养成分破坏的一级反应） 式中dc/dt：表示营养成分破坏的速率 C：表示营养成分的浓度 K：为反应速度常数，1/s，K = f(灭菌温度、菌种、培养基等),阿累尼乌斯公式,杂菌死亡的的速度常数K与温度T的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示

10、之： k = Ae-E /RT K：反应速度常数，1/S E：杀死杂菌所需的活化能（J/mol） 灭菌时，T由T1升到T2，杂菌死亡的的速度常数相除，得 k 1/ k2 = E /R(1/T1- 1/T1) （1）,培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行反应， 如下所示： B A C,营养成分破坏的反应速度常数K与T温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之： k = Ae-E /RT （1） 式中k：反应速度常数，1/S E：反应的活化能（J/mol） 灭菌时，T由T1升到T2，营养成分破坏的速度常数相除，得 k 1/ k2 = E /R(1/T1- 1/T2) （2）,对于

11、平行反应（1）式、 （2）式，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为： lg(k2/k1)/lg(k2/ k1)= E / E , (3,高温短时 灭菌理论根据,根据营养成分为破坏的反应的活化能E 、菌体死亡的活化能E （芽孢 或无芽孢 ）的比值， （3）式的比值 1 说明提高温度对于第一个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，营养成分破坏的反应速度常速增加的较少，因此，提高灭菌温度有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。通常所说的高温短

12、时 灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。,四、培养基的工业灭菌方法,培养基的湿热灭菌方法： 1.连消 定义：将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入到反应器的杀菌方法就是连消，又称连续灭菌。灭菌条件126-132，20-30s，在维持罐中保温8-20分钟。 所需设备：连消塔、维持罐及冷却器 优点：营养成分破坏少，生产效率高，热综合利用率高，大型企业自动化程度高。,培养基连消工艺流程图,2 .空消 定义：无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐和管道进行预先灭菌，称为空消。灭菌条件121，维持15-30分钟。 意义：由于空消时反应器内的死

13、角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。,3.实消 定义：将培养基置于反映器中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌。灭菌条件121，2030分钟 优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。,尽管，高温短时灭菌（连消）的优点非常明显，但目前我国发酵领域仍然是以分批操作的实消为主。,分批灭菌操作要点： 1、设备、管道气密性检查（有无渗漏）。 2、反应器空消 反应器升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气？当温度升到灭菌温度（ 121 ）时，进入保温操作阶段，此时要求与反

14、应器相连的所有管道出于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌，防止罐内气压过高。 3、发酵培养基的体积 配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。,4、培养基升温及保温 升温：打开所有的排气阀门，排掉空气？开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到80-90时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基升温到该温度时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。 保温：当培养基的温度升到灭菌温度（ 121 ）时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌，防止罐

15、内气压过高。 保温期间，要求罐压：0.10.12MPa，温度：118121，时间：20-30分钟。 5、灭菌结束后，维持罐内正压 灭菌结束后，立即引入无菌空气，保证罐内压力处于正压（0.0-0.05MPa）后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。,第二节 空气的净化,一、空气中微生物的分布,空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌和病毒。 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103-104个米3。 灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，所以空气除菌主要是去除空气中附着微生物的微粒(0.6-1m ）。,（一）发酵对空气无菌程度

16、的要求,密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要做到绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标； 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3,二、空气除菌,（二） 空气除菌的方法,辐射杀菌 热杀菌 静电除菌 过滤除菌,（1）辐射灭菌法,最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌。紫外光线的主要作用是使微生物的DNA分子产生的胸腺嘧啶的二聚体，导致细胞死亡。 无菌室常用的紫外灯功率为30W，安装在操作台上方一米左右高处，每次照射15-30min既可。 此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作人员在无菌室操作时应关闭紫外灯,（2）热灭菌,原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热变性而得以实现。,（3）静电除菌,静电除尘器可除去