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1、第六章 氨基酸与核酸发酵 第一节 谷氨酸生产 第二节 其他氨基酸发酵,一、氨基酸概论,1、氨基酸简介 构成蛋白质的基本分子单元。 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。,二、氨基酸的用途,（1）食品工业： 强化食品：赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。,（2）饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 ，添加蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸等必须氨基酸可促进动物生长发
2、育、改善肉质、节省蛋白饲料、降低成本等。 （3 ）医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 （4）化学工业： 能保持皮肤湿润的润肤剂焦谷氨酸钠和质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料。,表3-8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力,三、氨基酸的生产方法,发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养
3、缺陷型菌株发酵。 添加前体发酵法：如用邻氨基苯甲酸，生产L-色氨酸；甘氨酸生产L-丝氨酸。 酶法：利用微生物细胞或产生的酶来制造氨基酸。延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸。 提取法：常用毛发、血粉等蛋白质原料水解，从中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：合成法获得DL-蛋氨酸、不对称合成法获得L-氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的。,所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。 这些方法成立的一个重要原因是使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株
4、。,第一节 谷氨酸生产,一、生产原料及处理 淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、醋酸、乙醇、正烷烃等。 多数厂家以淀粉为原料生产谷氨酸，少数 厂以糖蜜为原料，这些原料一般要预处理。,糖蜜的预处理,目的：降低生物素的含量，因为含有过量的生物素会影响谷氨酸的积累。 处理方法： 1.活性炭处理 2.水解活性炭处理 3.树脂处理,淀粉的处理,谷氨酸生产菌都不能直接利用淀粉，所以必须将淀粉原料水解成葡萄糖后才能利用。 淀粉糖化后得到淀粉水解糖，主要是葡萄糖但是根据水解条件不同，还有少量的麦芽糖、二糖、低聚糖，葡萄糖是谷氨酸菌的营养物，所以淀粉水解液的质量是发酵产高酸的重要环节。 水解方法：酸解法；酶解法；酸酶结合
5、法,酸解法,利用无机酸为催化剂，在高温高压将淀粉转化为葡萄糖。 优点：工艺简单、水解时间短、效率高、设备周转快 缺点：要求有耐高温、耐高压设备，副产物也多影响糖的纯度。 糖化过程：酸作用于淀粉能生成糖，其中间物质有糊精、低聚糖、麦芽糖最后生成葡萄糖。,工艺流程,决定水解速度的因素：淀粉乳的浓度；酸的种类和用量；水解的温度和压力。,1.淀粉乳的选择：淀粉乳浓度低有利于水解。 2.催化作用是氢离子的催化作用：盐酸和硫酸，国内盐酸为主pH1.5左右 3.温度和压力对应：0.25-0.4mpa，时间20分钟,中和：淀粉水解葡萄糖后，作为催化剂的HCl必须除去。调节pH值4.5-5.0。 脱色：水解液中
6、有杂质，不利于发酵也不利于提取一般要进行脱色处理，活性碳吸附法 过滤除杂：温度高易过滤但胶体物质沉淀不完全；低温过滤，糖液粘度大过滤困难。一般60-70。,酶解法,先用淀粉酶将淀粉水解成糊精和低聚糖，然后再用糖化酶将糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖。 优点：条件温和、酶的专一性强、很少发生副产物,色泽浅，质量高。 缺点：时间较长、对温度和pH的变化比较敏感、酶活力随时间延长而下降，酶活力相差较大、设备较多,酶解法工艺条件,1.淀粉的液化：淀粉在淀粉酶的作用下分子断裂生成糊精及低聚糖粘度下降流动性增强 液化条件： 淀粉乳糊化是酶法制备淀粉糖的第一个必须步骤； 采用较高温度88-90； pH值6.0
7、-7.0酶较稳定； 淀粉的浓度控制在30%-35%； 酶活力稳定性与钙离子浓度有关，一般加氯化钙和硫酸钙调节钙离子浓度，一般0.01mol/L。,糖化：糖化酶将淀粉的液化产物糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。 糖化酶的来源:主要来自曲霉、根霉、拟内孢霉等 糖化工艺条件：不同来源的葡萄糖淀粉酶对糖化时温度和pH方面的要求存在差别。一般选择较高温度糖化，这样速度快。葡萄糖的复合反应发生程度与酶的浓度及底物浓度有关。,糖化操作,开口的装有搅拌和保温装置的糖化桶进行，糖化酶100单位/g干淀粉，pH值4.5左右，开始搅拌15min，后静置保温50-60摄氏度，糖化时间24h左右。为了缩短时间可中途
8、补加糖化酶，糖化结束升温至100，保持5min，以灭酶。,二、谷氨酸产生菌,谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium ghotamlkns) 黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) 乳糖发酵短杆菌(Bra. lactofementum) 嗜氨小杆菌(Microbaterium ammoniaphilmn) 硫殖短杆菌(Brevithiogenitalis)。 我国各味精厂使用的谷氨酸生产菌大部分是从自然界土壤中分离得到的野生型菌株通过诱变筛选的谷氨酸棒杆菌。 大部分以AS-1299为出发菌株经紫外线、硫酸二乙酯等复合诱变得到高产或耐高糖的菌株。,表1 谷氨酸发酵微生物特征
9、及菌学比较,谷氨酸合成途径,氨基酸合成的方式 1.氨基转移作用：转氨酶催化的转氨反应-酮戊二酸和其它氨基酸经过转氨酶的作用下使-酮戊二酸转化成谷氨酸。 2.还原氨基化作用：NH4+供氢体辅酶的存在下-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下生成谷氨酸。 3.谷氨酸合成酶催化反应：,谷氨酸的生物合成途径,1、谷氨酸生物合成中的几个途径（正常途径） （1）糖酵解途径 （EMP） （2）磷酸已糖途径 （HMP) （3）三羧酸循环(TCA环) （4）乙醛酸循环 （DCA环） （5）二氧化碳固定反应 PEP+CO2+GTP 草酰乙酸+GDP 丙酮酸+CO2+NADH 苹果酸+NAD 草酰乙酸 CO2 NAD+ N
10、ADH+H+ （6）-KGA的还原氨基化反应,PEP羧化酶,苹果酸酶,苹果酸脱氢酶,在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：,苹果酸酶 丙酮酸羧化酶 磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶,CO2固定反应(丙酮酸羧化支路),2、GA生物合成的理想途径具备的条件,（1）GA产生菌应具备以下条件（内在因素 ）,菌体有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性,KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP,提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系,该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联,生物素 供氧浓度 NH4+浓度,（2）影响谷氨酸合成的外在因素,a、生物素对糖代谢的影响,生物素参与
11、糖代谢作用：增加糖降解的速度,乳酸积累,碳源利用率降低，发酵液的pH值下降。,A、生物素对GA发酵的影响,主要影响糖降解速度，不影响EMP与HMP途径的比率。生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，引起乳酸的溢出。,控制生物素？,当VH缺乏时：,（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性 （2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这
12、样它的阻遏和抑制作用加强；乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动 两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。,b、控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭,c、生物素对氮代谢的影响,VH丰富时，出现“只长菌，不产酸”的现象,GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。,防止,关于氮代谢的调节： 控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。 在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，
13、琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。 在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。,d、VH对菌体细胞膜通透性的影响,通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度（干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）来实现的来实现对菌体细胞膜通透性的调节 。,葡萄糖,丙酮酸,+,丙酮酸,乙酰辅
14、酶A,乙酰辅酶,乙酰辅酶A羧化酶 （辅酶是VH ）,CO2,丙二酰辅酶A,丙二酰辅酶A,C4,C6,CO2,培养基中生物素限量时，胞内AA 92% 胞外,培养基中生物素丰富时，胞内AA 12% 胞外,CO2,Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适 量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失 调使Glu得以积累。,生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培 养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不 积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。 这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。,谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能
15、发生特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培养基中积累。,B、供氧浓度,过量：NADPH的再氧化能力会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。 供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,C、NH4+浓度,（1）影响到发酵液的pH值 （2）与产物的形成有关： 过低，不利于-KGA的还原氨基化；过高，产生谷氨酰胺。 NH4+的供给方式： （1）液氨 （2）流加尿素,研
16、究证明：,谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径有关 的酶,TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生 成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关,以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCA循环是C4 二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷 氨酸生成期此循环应关闭,谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和苹果 酸酶，与谷氨酸得率正相关,1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢 6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株,谷氨酸生产菌的具体育种思路 （谷氨酸代谢控制发酵的基本方法和实现的途径）,1.切断或减弱支路代谢 选育减弱-酮戊二酸进一步氧化能力的突变株 减弱-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。 选育减弱HMP途径后段酶活性
