外源基因的表达-2

《外源基因的表达-2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外源基因的表达-2（79页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1,第六章 外源基因的表达,2,基因工程的一个主要目的基因表达： 使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，改变生物性状或产生人们所需要的产品（如：蛋白质、多肽类生物药物）。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下翻译成蛋白质，蛋白质经过修饰后，最终表现出相应的功能。 基因表达的过程包括转录、转录后加工、翻译及翻译后加工。 它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。,3,第一节 基因表达机制,1.1 基因表达机制概述,基因表达必备的条件： 基因能够转录：要求基因上游有“启动子”，调控元件、下游有“终止子”。 转录产生的mRNA能够有效加工并保持稳定。 翻译

2、产生的蛋白质能够有效加工并保持稳定。 避免出现基因沉默,4,1.3 mRNA延伸和稳定性,转录启始后, RNA聚合酶延伸mRNA,至终止子处终止。 mRNA应在细胞中保持稳定的拷贝数：mRNA有半衰期，必须不停转录，才能保持稳定的拷贝数。,基因上游有启动子，一般应为诱导型； 存在有效的诱导剂； 没有阻遏物。,1.2 外源基因的起始转录,5,1.4 mRNA的加工,真核生物mRNA转录后需要剪切和拼接的加工过程。,原核生物mRNA有效翻译需考虑的基本原则： AUG（ATG）为起始密码子 SD 序列应包括AGGAGG中的4个. SD 序列与起始密码子间距3-9bp 起始区周围序列无二级结构. 外源

3、基因的主密码子与受体细胞的相同或接近. 主密码子:基因组中使用频率高的密码子 罕用密码子:使用频率低的 终止密码: E.coli. 一般用UAA. RF1识别UAA, UAG. RF2识别UAA, UGA.,1.5 mRNA的翻译,6,基因转录、翻译的动画演示,真核生物基因转录、转录后加工及翻译过程,原核生物基因的转录起始、转录、翻译过程,7,避免表达蛋白降解的方法: 采用融合蛋白表达系统 采用分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择无蛋白水解酶的受体。,1.6 表达蛋白的稳定性,8,基因沉默的形成机制主要有三种： 位置效应的基因沉默：整合入甲基化程度高、转录活性低的异染色体上，一般不表达。

4、 转录水平的基因沉默：启动子的甲基化或外源基因的异染色质体。 转录后水平的基因沉默：RNA水平上, 基因可转录,但mRNA合成后被降解或被反义RNA或蛋白质封闭. 转基因植物和转基因动物中常见。,1.7 基因沉默,9,序列特异性：几个保守的序列框。 方向性：启动子正反两种方向中只有一种具有启动功能。 位置特性：启动子只能位于所基因的上游或基因内的前端。 种属特异性：不同种属、不同组织的启动子不同。,第二节 基因表达的调控元件,2.1 启动子,10,原核生物启动子 转录起始位点:多为CAT, 从第二个碱基开始。 -10区：TATAAT，一般在起始位点上游6bp处。 -35区：TTGACA，一般在

5、起始位点上游35bp处。其中前个碱基高度保守 间隔区：-10区与-35区存在长度不等的间隔区，序列无保守性，间隔的长度非常重要。一般间隔16-18bp，E.coli.为17bp最好。 真核生物启动子,11,能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。 结构与启动子类似，由多个元件组成，每个元件与一种或多种转录调控因子结合。转录调控区通常有一至多个增强子。每个均有一种特定的功能：如在特定的发育阶段起作用。,2.2 增强子,增强子的特性 双向性：正反方向均可 重复序列：独立行使功能 功能的行使与位置无关：可上游、下游或中间 特异性：功能行使有组织特异性或发育阶段特异性。 可调节同源基因，也可调节异

6、源基因。,12,转录终止的位置 分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。,2.3 终止子,调节转录的起始和终止. Trp操纵子,2.4 衰减子,13,第三节 外源基因表达系统,外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。,3.1 定义,14,原核生物基因表达系统,真核生物基因表达系统,基因表达载体,受体细胞,3.2 种类,外源基因表达系统,基因表达载体,受体细胞,15,原核生物基因表达系统 大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统 蓝藻表达系统等。,真核生物基因表达系统 酵母表达系统 植物细胞表达系统 昆虫细

7、胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统,外源基因表达系统,3.2 种类,表达载体,受体细胞,16,3.3 原核生物与真核生物间基因表达的差别,原核生物基因表达,17,原核生物表达系统 基因表达：以操纵子形式进行。 当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA; 与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。,真核生物基因表达系统 转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和3末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。 mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加

8、工、糖化，形成高级结构。,3.3 原核生物与真核生物间基因表达的差别,18, 多数为单细胞, 异养，生长快，代谢易于控制，可迅速获得大量产物。 基因组结构简单，便于操作。 含有质粒或噬菌体，便于构建表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控比较清楚。 不具备蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。,3.4 原核生物作为基因表达系统的特点,19,大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。 应用最广泛的基因表达系统。,第四节 大肠杆菌基因表达系统,20,大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景

9、清楚，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解； 大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列； 实验已经证明，许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达； 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。,4.1 大肠杆菌表达系统的优越性,21,大肠杆菌基因表达载体中包括3个系统：,DNA复制及重组载体的选择系统 （复制子、选择标记）,外源目的基因的转录系统,蛋白质的翻译系统,4.2 大肠杆菌基因表达载体,基因表达载体,22,复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。,大肠

10、杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有 可有效复制的复制子。,4.2.1 DNA复制及重组载体的选择系统,23,常见的复制子,pMB1、p15A、ColE1：松弛复制型，每细胞质粒拷贝数1020个。,pSC101：严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。,在同一大肠杆菌细胞内， 含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存 含不同类型复制子的不同质粒载体可以共存, 复制子,24, 选择标记,目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。,微生物表型选择标记,显性标记,营养缺陷型标记,抗菌素抗性标记,颜色标记,25,抗菌素抗性标记：在质粒载体中最常用。原因：许多质粒本身就带有抗菌素

11、抗性基因；再有抗菌素抗性记号便于操作、易于选择等。 主要抗菌素标记 氨苄青霉素抗性 四环素抗性 链霉素抗性 氯霉素抗性 卡那霉素抗性,26,27,包括：启动子、抑制物基因和终止子。 启动子和终止子：因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。,4.2.2 转录系统,28, 启动子,外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。 选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。,29,抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。 在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重

12、新恢复。, 抑制物基因,30,抑制物基因产物的作用：使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时机尤其重要。 理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。,31,转录终止子：一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。,转录终止子的功能： 使转录在目的基因之后立即停止。 控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。, 转录终止子,目的基因在强启动子的控制下容易发生转

13、录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物，影响mRNA的翻译效率，使外源基因的转录速度降低。 因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表达的目的。,32,原核生物中影响翻译起始的因素： 起始密码子 核糖体结合位点（SD序列） 终止密码子 起始密码子与SD序列之间的距离和碱基组成 mRNA的二级结构 mRNA上游的5端非翻译序列 蛋白编码区的5端序列等。,4.2.3 翻译系统,33,例如： 起始密码子与SD序列之间的距离：68bp，多数为7bp。 SD序列后面的碱基组成：为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高；为CCCC或GGGG是，翻译起始效率分别为最高的50%

14、和15%。,34,翻译系统,核糖体结合位点,翻译起始密码子,翻译终止密码子,35, 核糖体结合位点,核糖体结合位点：原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）。 SD序列与核糖体16S rRNA特异配对而使mRNA与宿主核糖体结合，对“翻译”起着决定性的作用。 SD序列与核糖体16S rRNA的互补性高，核糖体与mRNA的结合程度越强，翻译的起始效率越高。 大肠杆菌SD序列的碱基组成为：5 AGGAGG 3 其中以GGAG最为重要，任何一个发生突变都会使翻译效率的大幅度下降。,36, 翻译起始密码子,起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（A

15、TG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。 GUG、UUG：有极少数生物利用。,37, 翻译终止密码子,翻译终止密码子：能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。 在大肠杆菌中，新合成的多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控。 RF1识别终止密码UAA和UAG， RF2识别终止密码UAA和UGA 由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。 通常将几个终止密码串连在一起，以保证翻译的有效终止。,38,小节,DNA复制及重组载体的选择系统,外源基因的转录系统,蛋白质的翻译系统,基因表达载体,复制子 选择标记,启动子 抑制物基因 终止子,翻译起始

16、密码子 核糖体结合位点 翻译终止密码子,39,大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统 大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子。 大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。,4.3 宿主菌,4.3.1 重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因,40,4.3.2 常见的大肠杆菌基因表达受体菌株,41,Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。 PL和PR表达系统：是以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。 T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。,4.3.3 常见的大肠杆菌基因表达系统（了解）,42,表达产物的存在部位 细胞质 细胞周质 细胞外培养基 表达形式 不溶性蛋白 可溶性蛋白,4.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式,43,包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起，形成无膜的裸露结构，称为包涵体。 包