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1、（二）RNA的复制（RNA指导RNA 合成） 某些 大肠杆菌噬菌体，如f2、MS2、R17H和Q是RNA病毒。这些RNA病毒的染色体RNA的功能好似病毒蛋白质的mRNA，它是在宿主细胞中由RNA指导的RNA聚合酶或称RNA复制酶（replicase）催化合成的。RNA复制酶不存在于正常的大肠杆菌细胞中，感染时才有宿主产生。 1、噬菌体QRNA的复制：从 Q噬菌体感染的大肠杆菌细胞中提出的RNA复制酶用四种核苷三磷酸为底物，催化合成与病毒RNA碱基序列互补的RNA链，和DNA指导的RNA聚合酶所催化的反应类似。 复制酶的特异性非常高，它只识别病毒自身的RNA ，而对宿主细胞和其它与病毒无关 的R
2、NA均无反应。即Q的复制酶只能以噬菌体Q RNA作模板，其它的都不行。 当噬菌体Q的RNA侵入大肠杆菌细胞后，其RNA本身即为mRNA，可以直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质的合成，通常将具有mRNA功能的链称为正链，而它的互补链为负链。故噬菌体QRNA为正链。在噬菌体特异的复制酶装配好后不久，酶就吸附到正链RNA的3-末端，以正链为模板合成出负链RNA，直至合成进程结束，负链从模板上释放。同样的酶又吸附到负链RNA的3-末端，并以负链为模板合成正链。所以两链都是以5至3方向延长。在最适条件下，无论正链或负链的合成速度均为每秒35个核苷酸。其合成过程如下图所示：,2、病毒RNA的复制方式：病毒RN
3、A的种类很多，其复制的方式也是多种多样的，归纳起来可以有下列几种： （1）病毒含有正链RNA，进入宿主细胞后首先合成复制酶（以及有关蛋白质)，然后在复制酶作用下进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配称病毒颗粒。噬菌体Q和灰质炎病毒（poliovirus）即时这种类型的代表。 （2）病毒含有负链RNA和复制酶，例如狂犬病毒（rabies virus）和马水疱性口炎病毒（vesicular-stomatitis virus）。这类病毒侵入细胞后，借助于病毒带进去的复制酶合成出正链RNA，再以正链RN为模板，合成病毒蛋白质和复制病毒RNA。 （3）病毒含有双链RNA和复制酶，例如呼肠孤病
4、毒（reovirus）。这类病毒以双链RNA为模板，在病毒复制酶的作用下通过不对称的转录，合成出正链RNA，并以正链RNA为模板翻译成病毒蛋白质。然后再合成病毒负链RNA，形成双链RNA分子。 （4）致癌RNA病毒，主要包括白血病病毒（leukemia virus）和肉瘤病毒（sarcoma virus），它们的复制需经过DNA前病毒阶段，有逆转录酶所催化。这类病毒的复制过程，前面已有介绍。 不同类型的RNA病毒产生mRNA的机制大致可分为四类。即： 双链RNA （+）RNA（）RNAmRNA（+） 双链DNA （）DNA （+）RNA （）RNA,由上看出，由病毒mRNA合成各种病毒蛋白质，
5、再进行病毒基因组的复制和病毒装配。因此病毒mRNA的合成在病毒复制过程中处于核心地位。 （三）RNA的转录后加工和修饰 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primary transcript）往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、5-端于3-端的切除和特殊结构的形成、碱基的修饰和糖苷键的改变、以及拼接（splicing）等过程，才能转变成成熟的RNA分子。此过程称为RNA的成熟，或称为转录后加工（post transcriptional processing）。 原核生物的mRNA一经转录通常立即进行翻译，除少数例外，一般不经过转录后加工，但tRNA和rRNA却都要经过一系列加工才能
6、成为由活性的分子。真核生物由于具有细胞核结构，转录与翻译在时间上和空间上都被分隔开来，其mRNA的加工极为复杂。 1、原核生物中的RNA的加工 （1）rRNA前体的加工：原核生物的rRNA都是从较长的前体生成的，这种前体也称为”前核糖体RNA“。原核生物的16S和23S的rRNA是从分子量约为200万的30SrRNA前体产生的。30SrRNA前体先在特定碱基处甲基化，然后断裂产生17S和25SrRNA中间产物。再经过核酸酶的作用除去一些核苷酸残基，才生成原核生物特有的16S和23SrRNA。5SrRNA是从30SrRNA前体的3端分离的。,(2)tRNA前体的加工：tRNA也从较长的前体产生。
7、细胞内有数十种tRNA，各种tRNA的前体结构和加工方式不尽相同。一般在加工过程中除去前体5和3端多余的核苷酸。有时tRNA前体酶解可产生二个活多个不同的tRNA。总之，其加工包括：由核酸内切酶在tRNA两端切断；由核酸外切酶从3端逐个切去附加的顺序，进行修剪；tRNA3端加上胞苷酸-胞苷酸-腺苷酸（-CCA）；核苷的修饰（甲基化、脱氨和还原作用等）。 细菌的tRNA前体存在两类不同的3端序列。一类其自身具有CCA序列，位于成熟的tRNA序列与3端附加序列之间，当附加序列被切除后即显露出该末端结构。另一类其自身病不存在CCA序列，当前体切除3端附加序列后，必须外加CCA。添加CCA是在tRNA
8、核苷酰基转移酶（nucleotidyl trans-ferase）催化下进行的。 （3）mRNA前体的加工：细菌中用于指导蛋白质合成的mRNA大多不需要加工，一经转录即可进行翻译。但也有少数多顺反子的mRNA须通过核酸内切酶切成较小的单位，然后再进行翻译。,2、真核生物RNA前体的加工:真核生物rRNA和tRNA前体的加工过程与原核生物有些相似，然而其mRNA前体必须经复杂的过程，这与原核生物大不相同。真核生物大多数基因具有居间序列（intrvening sequence），即内含子（intron）所分隔而成为断裂基因（interrupted gene）。所以需在转录后将其内含子切除并通过拼接
9、使编码区成为连续序列。 （1）真核生物rRNA前体的加工：在真核生物中，一个大45SrRNA前体经过一系列步骤生成18S和28S的rRNA。45S的rRNA前体的加工在核仁中进行。45SrRNA前体约含14000个核苷酸残基，加工的第一步是其中100多个核苷酸残基被甲基化，其中多数残基的甲基化部位是其核糖部分的2-OH。甲基化的45SrRNA前体再进行一系列的酶促分解后产生真核生物核糖体特有的18S、28S和5.8SrRNA。真核生物5SrRNA的生成通过另外的途径。 多数真核生物的rRNA基因不存在内含子。有些rRNA基因含有内含子但并不转录。例如，果蝇的285个rRNA基因组中约含有三分之
10、一的内含子，它们均不转录。四膜虫（Tetrahymena）的核rRNA基因和酵母线粒体rRNA基因含有内含子，它们的转录产物可自动切去内含子序列（见下页图）。 。,（2）真核生物tRNA前体的加工：真核生物的tRNA基因的数目比原核生物tRNA基因的数目大得多。例如大肠杆菌基因组约含有60个tRNA基因，果蝇850个，而人体细胞则有1300个。真核生物的tRNA基因也成簇排列，并且被间隔区分开。转录产物为4.5S或稍大的tRNA前体，相当于 100个左右的核苷酸。成熟的分子为4S，约含70-80个核苷酸。前体分子的5端和3端都有附加序列，需由核酸内切酶和外切酶加以切除。真核生物的tRNA前体的
11、3端不含CCA序列，成熟分子中的是后来加上去的。在分子中还具有2-O-甲基核糖，含量约为核苷酸的百分之一。具有居间序列的前体还必须将这部分切除,（3）真核生物mRNA前体的加工：真核生物编码蛋白质的基因以单个记忆作为转录单位，不象原核生物那样组成操纵子，其转录产物为单顺反子mRNA ，而不是多顺反子mRNA。大多数蛋白质基因具有居间序列，它与编码序列一起被转录，需要在转录后加工过程中切除掉。mRNA的原初转录产物是分子量极大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,缩写为hnRNA），其中至少有一部分可转变
12、成细胞质的成熟mRNA。 由hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：5端形成特殊的帽子结构（m7G5ppp5NmpNp-）；在链的3端并加上多聚腺苷酸（ polyA）；通过拼接除去由内含子转录来的序列；链内部核苷被甲基化。 5帽子和3多聚腺苷酸的功能还未确定。具认为5帽子可能参与mRNA与核糖体的结合以起始翻译过程；也可能5帽子和多聚腺苷酸保护mRNA使之免受酶的破坏。此外，多聚腺苷酸还与mRNA顺利通过核膜进入细胞质的过程有关。,在基因转录过程中，内含子与外显子同时被转录，产物为RNA前体，然后切除前体的内含子，这种过程称为RNA的剪接（RNA Splicing）。 有关RNA的剪接机制是近
13、年来分子生物学最热门的课题之一。不同RNA内含子的剪接方式不近相同。真核生物细胞mRNA前体是剪接是在形成剪接体后才能进行。剪接体是包括mRNA前体在内的多组分复合物，由几种小核RNA（snRNA）和几十种蛋白质构成。 其剪接过程见下图：,四、基因工程简介,DNA重组技术指将不同的DNA片段按人们的设计方案定向连接，并在特定受体细胞中与载体一起得到复制与表达（70年代，基于DNA限制新性内切酶、DNA连接酶的发现）。 基因工程主要包括两个步骤： 获得目的基因，取得基因的载体，使二者进行体外重组。 将重组的DNA转化到受体的活细胞中去，改变受体细胞的遗传特性。,一、目的基因的制备 二、基因载体
14、载体必须具备的条件（易于引入受体细胞、在受体 细胞中可以复制、易于鉴定和筛选、） 目前常用的载体：质粒、噬菌体（噬菌体、噬菌体M13） 三、DNA的重组 重组体DNA的连接 将重组DNA引入受体细胞（转化） 重组体的筛选,思考题： 1.比较原核生物与真核生物复制和转录的区别 2.试从已经学过的各章代谢中找出与天冬氨酸有关的反应或与天冬氨酸相联系的环节。 3.解释下列概念：复制、转录、启动子、操纵子、终止子、衰减子、增强子、转录复合体、逆转录酶和逆向转录。 4. 噬菌体M13 DNA具有如下的碱基组成： A 23% T.36% G21% C.20% 5.胞嘧啶碱基自动脱氨以很低的频率出现,但可以检测到.胞嘧啶脱氨后转变成尿嘧啶.在这种转变之后,什么样的碱基配对占据第一轮复制的子代股的这个位置?第二轮呢?.,
