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1、,报告人：Adam 2014-11-20,miR-26a抑制炎症相关性结直肠癌的发生发展及其机制研究,miR-26a：微小 RNA （microRNA ）是一类长约 22 nt 的核苷酸单链小分子 RNA ，分布于各种生物中，对基因的表达起着重要的调控作用。目前miR-26a在肿瘤中研究如火如荼，尤其以肝癌中的研究最多。miR-26a在肝癌中低表达，机体炎症反应增强，肝癌加重。然而关于miR-26a在结肠癌中的表达情况、生物学功能以及参与结肠癌发生发展中的作用机制文献报道较少。,关键词,炎症相关性结直肠癌：由结肠或直肠炎症引起的结肠或直肠癌 炎症微环境可以影响肿瘤的发生和肿瘤形成，从临床前研究
2、和临床研究通过潜在分子机制已经证明炎症持续发生会导致肿瘤的发生，是发生癌变的高危因素。流行病学研究显示，包括溃疡性结肠炎的炎症性肠病发生癌变的机制为：发炎黏膜增生性病变-不典型增生-癌变 。由炎症诱发的癌变机制包括：炎症诱导活性氧和活性氮产生、诱导的基因组不稳定、基因突变后的倍性、增强细胞增殖、基因异常表达、抗凋亡、肿瘤的血管可以新生以至于更具侵略性、穿透基底膜导致肿瘤转移。这些机制可以直接或是间接的通过损伤重要的细胞成分(例如DNA、蛋白质和脂质)，促进细胞恶性转化。炎症已经成为癌症的第七大特征，慢性炎症的持续刺激是多种肿瘤产生的关键原因。,关键词,AOM/DSS诱导的炎症相关性结直肠癌模型
3、：氧化偶氮甲烷 (azoxymethane, AOM)/ 葡聚糖硫酸钠 (dextran sodium sulfate, DSS) 小鼠模型是一种在致癌剂 AOM 和致炎剂 DSS 协同作用基础上， 由炎症性肠病 (inflmmatory bowel disease, IBD) 逐步发展为结直肠癌的炎症相关性癌症的研究模型。 AOM/DSS 模型能很好地模拟慢性肠道炎症诱发癌症的生理病理过程， 近年来被广泛用于炎症相关性癌症形成机制的研究。,关键词,AOM/DSS 模型诱导方法主要有两种 ：“ 四 步法” 为 AOM 单剂量 (7.512.5mg/kg) 腹腔注射后， 即时或 1 周后饲喂含
4、1%3%DSS 饮水 7 d ( 也有 4 d)， 之后改为正常饮水 14 d为 1 个循环， 共循环 3 次 ；“ 两步法” 与前者的区别在于将 3 次循环的 DSS 处理缩短为单次循环，共两步完成 。 四步法较两步法加速了肿瘤的生长 。,psiCHECK2双荧光素酶系统：由promega公司研发，双荧光素酶报告基因在同一载体上。其中，海肾荧光素酶基因 ( hluc)为报告基因，萤火虫荧光素酶基因 ( Fluc) 为内参基因， 两个荧光素酶基因都有自己的启动子、终止位点，二者独立表达互不干扰。该载体可快速准确地反应微小NA(microNA，miNA)和NA干扰(NA interference
5、，RNAi) 对靶基因的调控作用效果，但需要特定的荧光素酶检测试剂盒和荧光素酶报告基因检测仪。,关键词,双荧光素酶系统实验方法： （1）PCR扩增靶基因的3UTR，或直接合成结合位点序列； （2）将上述DNA片段克隆至报告载体psiCHECK质粒； （3）合成miRNA 模拟物； （4）将报告载体与miRNA模拟物共转待检细胞； （5）多功能酶标仪检测报告基因的表达水平。,转基因小鼠制备,诱导炎症相关性结直肠癌,ELISA、WB、q RT-PCR检测炎症因子，HE染色病理观察,软件分析miR-26a靶蛋白,双荧光素酶系统验证,Mimics高表达miR-26a，CCK-8、WB、qRT-PCR检
6、测,转基因小鼠体内炎症靶蛋白,临床样本检测,课题设计,1.分别制备全身细胞过表达miR-26a、髓系细胞过表达miR-26a和肠上皮细胞过表达miR-26a的转基因小鼠；利用AOM/DSS诱导转基因小鼠发生炎症相关性结直肠癌,实验分组 正常小鼠对照组 全身过表达组 髓系细胞过表达组 肠上皮细胞过表达组 预期结果 获得不同部位高表达miR-26a的结直肠癌小鼠模型。,2.ELISA检测各类转基因小鼠外周血中炎症相关因子如：IL-1、IL-6、IL-10、IL-23、TGF-、NF-kB、TNF-、TNF-等；WB和qRT-PCR检测肿瘤组织中的炎症相关因子；以及大肠组织切片观察病理形态及肿瘤组织
7、形态,实验分组 正常小鼠对照组 全身过表达组 髓系细胞过表达组 肠上皮细胞过表达组 实验方法 ELISA WB qRT-PCR HE染色 预期结果 确定小鼠模型中miR-26a高表达对炎症因子表达和癌症发展的影响。,3.选择靶基因搜索数据库TargetScan和PicTar软件预测miR-26a的靶基因，对两种预测软件获得的靶基因取交集作为miR-29a的靶基因集合。查阅文献寻找可促进炎症反应及细胞增殖的蛋白,预期结果 找到能够促进炎症反应及细胞增殖的miR-26a靶蛋白。,4.在293T细胞中以psiCHECK2.2双荧光素酶系统验证靶基因,实验分组 psiCHECK2空载与阴性对照 psi
8、CHECK2空载与miR-26a mimics psiCHECK2-3UTR与阴性对照 psiCHECK2-3UTR与miR-26a mimics 预期结果 海肾荧光素酶表达，萤火虫荧光素酶表达； 海肾荧光素酶表达，萤火虫荧光素酶表达； 海肾荧光素酶表达，萤火虫荧光素酶表达； 海肾荧光素酶低表达，萤火虫荧光素酶表达； 验证软件寻找的靶基因确实能与miR-26a特异性结合。,5.用mimics高表达SW620细胞中的miR-26a，CCK-8检测细胞增殖，WB和qRT-PCR检测靶蛋白、各种炎症相关因子的表达情况和mRNA水平,实验分组 正常对照组 阴性对照组 Inhibitor组 实验方法 C
9、CK-8 WB qRT-PCR 预期结果 miR-26a的高表达抑制细胞增殖，减少靶蛋白和炎症因子的表达，体外验证靶蛋白。,6.在三种不同的转基因小鼠大肠组织中WB检测靶蛋白的表达情况,实验分组 正常小鼠对照组 全身过表达组 髓系细胞过表达组 肠上皮细胞过表达组 实验方法 WB 预期结果 体内验证靶蛋白,7.取不同病理期的结直肠癌患者外周血和肿瘤组织，检测miR-26a和炎症因子表达情况，病理切片分析miR-26a、炎症因子浓度和肿瘤发展情况，以正常体检患者外周血和癌旁组织为正常对照,实验分组 正常体检样品 不同病理期临床样品 实验方法 ELISA WB qRT-PCR HE染色 免疫组化 预期结果 了解临床样本中miR-26a与炎症因子、肿瘤发展的关系。,预期结果,Thank you !,
