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1、1,传染性疾病的诊断,2,病原微生物,病原微生物是指可以侵犯人体,引起感染甚至传染病的微生物,或称病原体。 病原微生物有朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒 等。,3,传染性疾病诊断的意义,传染病是人类主要的疾病,近30年的新发传染病中,60%为病毒引起的 保护机体健康、有效治疗 控制疾病流行和蔓延 提高人口质量,优生优育(监控垂直传播的病毒和检测导致胎儿畸形的病毒),4,5,致病微生物的分子诊断策略,完整病原体 核酸 蛋白 在体内留下的痕迹 以病毒为例,分子诊断,6,标本的采集,根据临床诊断、流行病学分析和病毒的致病性等,确定采集合适的标
2、本 血液病毒的抗体 脑脊液神经系统感染 鼻拭子、咽拭子呼吸道感染 粪便肠道感染 疱疹液、尿液、眼泪、精液、阴道分泌液等,7,致病性机制不明的病毒感染,采集多部位的标本 采集标本必须快速、低温,以保证检测的准确性,8,完整病原体的分离与培养,实验室诊断,流行病学研究 分离病原体“诊断的金标准”,在诊断病原体中占重要地位,9,由于病毒是严格的细胞内寄生物,所以,病毒分离必须涉及“活细胞”细胞、动物和鸡胚 动物接种 是最原始的病毒培养方法:根据病毒种类不同,选择敏感动物及接种部位嗜神经性病毒(狂犬病毒)接种于小鼠脑内;痘病毒接种于家兔角膜,10,实验动物,11,鸡胚培养 鸡胚对多种病毒敏感:一般采用
3、孵化914天的鸡胚,根据病毒种类不同,将病毒标本接种于鸡胚的不同部位羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等,12,13,14,细胞培养 (cell culture)法 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称,然后加入病毒进行培养、分离鉴定,是病毒分离和培养中最常用、最基本的方法,15,细胞培养瓶,细胞培养板,培养基,16,17,细胞病变效应(CPE),18,形成合胞体,19,红细胞吸附 (hemadsorption, HAd) 流感或副流感病毒等感染细胞后,由于细胞膜上出现了血凝素(HA),具有吸附脊椎动物 (豚鼠、鸡、猴等) 红细胞的能力,这一现象称红细胞吸附,常用来测定具有HA的
4、粘病毒与副粘病毒的增殖,20,红细胞,红细胞吸附,21,优点 在选择了正确宿主细胞时,敏感性很高 发现多种不同的病毒 特异性较高 缺点 费时费力,时间3-21天 敏感性的高低受到宿主细胞的影响 有些病毒不能在体外培养,因而会造成假阴性的结果 有些病毒因长时间培养而失去了临床应用价值,22,完整病原毒的电镜检测,实验室快速诊断方法 重要检测方法之一 依靠病毒的形态来诊断,23,优点 快速(30分钟2小时2天) 发现新病毒 适用于一些难以培养或迄今尚不能培养的病毒 缺点 仪器昂贵,需要专业人员 敏感性低,病毒浓度低时假阳性、假阴性率高 特异性低,一般仅能确定到“科” 不能批量检测,24,痘病毒科,
5、虹病毒科,多DNA病毒科,25,疱疹病毒科,多瘤病毒科,乳头瘤病毒科,26,杆状病毒科,非洲猪瘟病毒科,腺病毒科,27,细小病毒科,嗜肝DNA病毒科,逆转录病毒科,28,正粘病毒科,布尼亚病毒科,沙粒病毒科,29,病毒感染的诊断方法,采集标本,电镜检查病毒颗粒,病毒组分的检测,病毒的分离和培养,抗体的检测,抗原,核酸,30,病原体的分子诊断,核酸检测:核酸分子杂交、PCR、生物芯片等 病毒蛋白(抗原)检测:ELISA、化学发光免疫、免疫层析等 抗体:ELISA、化学发光、免疫层析等,31,临床常用的传染性疾病诊断试剂,优生优育系列:TORCH 肝炎系列:甲、乙、丙、丁、戊、庚型病毒性肝炎 性病
6、系列:梅毒、胞疹病毒、衣原体、支原体、淋病和艾滋 呼吸道传染病系列:流感、SARS等,32,血液传染病筛查系列,献血者健康检查要求对献血者所捐献血液进行严格的初、复检两次检测。,1.ABO血型正反定型、Rh血型:正反定型相符,血清中无意外抗体 2.血红蛋白测定:硫酸铜法:男1.052,女1.050;相当于男120g/L, 女110g/L 3.丙氨酸氨基转移酶(ALT):ALT速率法40单位 4.乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg):阴性 5.丙型肝炎病毒抗体(HCV抗体):阴性 6.艾滋病病毒抗体(HIV抗体):阴性 7.梅毒试验:阴性,33,快速 灵敏 监控机体对病毒的免疫状态 大批量筛查,抗
7、体检测的优点有,34,优生优育系列检测试剂盒,TORCH系列 弓形虫(Toxophasma ) 风疹病毒(Rubella.Virus) 巨细胞病毒(Cytomegalo.Virus) 单纯疱疹病毒I/II(Herpes.Virus),35,TORCH系列结果分析,结果中的IgM抗体:阳性结果提示近期有感染,结合其他情况,终止妊娠。 结果中的IgG抗体:阳性结果提示过往感染,具有一定的保护性。,36,乙型肝炎病毒的检测,现状 全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒,中国有1.2亿人感染,其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡,37,HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程,38,诊断乙肝的指标
8、,生化指标:ALT 免疫学指标:“两对半” 乙肝表面抗原(HBsAg)(携带者指标) 乙肝表面抗体(Anti-HBs) 乙肝e抗原(HBeAg)(活动指标) 乙肝e抗体(Anti-HBe) 乙肝核心抗体(Anti-HBc) 病毒学指标:HBV-DNA,39,40,41,乙肝检测方法:,“两对半”:ELISA、化学发光免疫分析 乙肝病毒(HBV)核酸:PCR(实时荧光定量PCR),42,丙型肝炎病毒的检测,现状 全球HCV的感染率约为3,估计约1.7亿人感染了HCV,每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。我国血清流行病学调查资料显示,我国一般人群抗HCV阳性率为3.2,全国感染HCV人数约4000万
9、。,43,HCV抗原,44,45,HIV的检测,人类免疫缺陷病毒(HIV)感染,获得性免疫缺陷综合征(AIDS) 病毒抗原检测:gp120、gp24等 病毒抗体检测:anti-gp120、anti-gp24等 核酸检测:逆转录病毒,需反转录PCR,46,HIV感染后的免疫情况,47,HIV抗体检测的目的,HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势,检测的人群包括各类高危人群和一般人群。 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况,包括临床检测和自愿咨询检测(VCT) 、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。 以血液筛查为目的的检测是
10、为了防止输血传播HIV,包括献血员筛查和原料血浆筛查。,48,检测程序,筛查试验 重复检测 确认试验,49,筛查试验方法,用于检测HIV抗体筛查试验的试剂盒种类很多,目前常用的筛查试剂有酶联免疫试验(ELISA)、明胶颗粒凝集试验(PA)、斑点ELISA、斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验、唾液检测卡、其它快速筛查试验、尿液HIV抗体检测。 第一个用于HIV抗体诊断的试剂盒于1985年问世, ELISA最常用。操作简单、价格便宜,敏感性、特异性较好,适合我国国情。,50,筛查试剂的要求,筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。 推荐使用经
11、临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。,51,HIV抗体筛查试验结果,筛查试验(-) 出具“HIV抗体阴性”报告 筛查试验(+) 出具“HIV抗体待复查”, 不能出阳性报告,52,复 检,初次筛查时发现阳性反应,应及时进行复检,复检时除了原标本外尚需重新采集标本一份。(这样既可核对原有检测和复检结果一致性,又可了解有无血液标本受污。)两份标本同时送检。 国际上均认为复检阳性才是做确认检测的指征。,53,复检时的检测试剂,应该用2种不同原理的试剂。 有时由于条件限制,当用ELISA筛查呈阳性反应,在重复检测标本时,如用快速试剂往往敏感性不高,故只好提出用两种不同厂家制造或用原试剂外再用一种高质量的
12、ELISA试剂进行检测。,54,HIV抗体检测的要点,筛查试验阳性不能出阳性报告。 严格遵守实验室标准操作程序(SOP)。 严格按照试剂盒说明书操作,不得擅自更改。 注意防止样品间交叉污染。 注意安全防护。,55,HIV抗体确认试验,包括免疫印迹实验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIV)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA) 只有HIV抗体确认实验结果判为阳性的 才能出具“HIV抗体阳性”的报告,56,HIV确认实验,57,HIV核酸检测,早期诊断 :婴儿 疑难样本的辅助诊断 遗传变异监测 耐药性监测 病程监控及预测 指导抗病毒治疗及疗效判定,58,谢谢 你们的宝贵时间,