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1、Western blot 实验技术,曹 红 2012.11.15,定义:,印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。,Western blot 原理,Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋
2、白质混合物,经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物(NC膜,PVDF膜等)上后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与其对应的抗体起免疫反应,再与酶标记的二抗体起反应,经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。 由于Western blot检测技术具有简便,快捷等特点,所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。,Western Blot 信号放大基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,底片扫描、分析,底物显色
3、,二抗孵育,一抗孵育,封闭,转膜,SDS-PAGE电泳,蛋白样品的制备,培养细胞:洗掉培养基,PBS洗23次,加入裂解液,用细胞刮刀将贴壁细胞刮下,超声波匀浆器匀浆,冰上静置30分钟,4度,12000转,离心15分钟,收集上清. 组织样品:快速取材、液氮速冻、按每80毫克组织加1毫升的比例加入裂解液,超声波匀浆器匀浆,静置60分钟,4度,12000转,离心15分钟,收集上清. 样品保存:避免反复冻融样品,EP管分装 -20度保存,不要超过2周,最长不要超过1个月;-80度(或-70度)保存,一般不超过半年,最多1年。 裂解液: Tris-HCl, EDTA, NP40 , CHAPS, PMS
4、F , protein inhibitor ,(磷酸酶抑制剂:氟化钠、钒酸钠),蛋白样品的制备,BCA(bicinchoninic acid, 二辛可酸)法测定蛋白浓度,原理:在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物, 在562nm除有高地光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。 浓度检测范围:10 - 2000ug/ml 步骤:(1)标准品与待测样品稀释(至检测范围);(2)与等体积WR工作液混合;(3) 37度反应2hr;(4)测定562nm处光密度(OD)值; (4)绘制标准曲线并计算蛋白浓度,SDS-PAGE(p
5、olyacrylamide gel electrophoresis, 聚丙烯酰胺凝胶电泳),原理: 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应. SDS (十二烷基硫酸钠)是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS后後,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动
6、速率就只剩下分子大小一项因素。,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液(积层胶:PH=6.8;分离胶:PH=8.8) TEMED(四甲基己二酸),加速剂,催化APS产生自由基 过硫酸铵(现配现用):产生自由基,并引发丙烯酰胺单体聚合 Tris-甘氨酸电泳缓冲液(PH=8.3),凝胶成份,SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。 不连续体系由电极缓冲液、凝胶(积层胶和分离胶)所组成。积层胶是由APS催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl。分离胶是由APS催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.8 Tri
7、s-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,因而其分离条带清晰度及分辨率均较好。,凝胶浓度与蛋白分离范围,制备样品,样品缓冲液: 1)SDS:断裂分子内和分子间的氢键,取消蛋白质分子内的疏水作用,使分子去折叠,破换蛋白分子的二、三级结构;去除蛋白质电荷。 2)强还原剂:如beta巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇),能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 3)溴酚蓝:指示剂 步骤: 混匀、沸水煮5min, 4度离心,置冰上备用。 注意:处理好的样品液如经长期存放,使用前应在沸水浴中加热1-
8、3分钟,以消除亚稳态聚合。,蛋白marker,NEB蛋白marker,Bio-rad彩虹marker,凝胶染色,标准考马斯亮蓝染色法 (1)电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中); (2)室温下振摇温育至过夜; (3)去除染色液,收集保存可重复使用20-40次; (4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白每条带。 注:使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热,(大约50-60),染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-
9、2h。,操作图示,注意事项,(1)所有蛋白样品定量一致,体积一致,不够的用裂解液补满,样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样,Marker也用1loading buffer调整至与样品等体积,这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散,使最边上的孔道电泳出现误差。 (2)Western Blot一般上样30100微克不等,结果跟目的蛋白的含量、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以调整。 (3)积层胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ,如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前
10、进入分离胶。而在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好,浓缩胶80v,分离胶100v就能跑得很好,同时制胶前一定要使胶混匀,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶,使胶不均匀。 (4)pH对整个反应体系的影响是至关重要的,在SDSPAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是TrisHCL缓冲系统,积层胶是pH6.8,分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris甘氨酸缓冲系统,PH8.3,PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理: 一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差,背景相对较弱。 尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合(注:常用的
11、PVDF即带正电荷的尼龙膜),同时也有疏水作用,但相对较弱,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好,但背景相对较强。 分类: 半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统,将膜,胶,滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的,叫湿法;用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。BIO-RAD的半干转运系统的弱点就是无法控温,当电流过高,而系统的散热又比较差,滤纸的吸水性比较差的情况下,就很容易烧胶。,转膜,转膜步骤,半干实验步骤: 先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s,在放入转膜缓冲液里浸泡数分钟。每块胶用60mA,1h,从下到上的顺序:阴极/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸, 凝胶面向
12、阴极,保持湿润和没有气泡。必要时可先用丽春红染色(2%乙酸,0.5%丽春红的水溶液)观察蛋白条带转移到膜上的效率。 湿转实验步骤: 将膜,凝胶放置到湿转夹子中,膜面向正极,凝胶面向负极,300 mA横流转膜1.5-2小时,时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进行相应调整,转膜后丽春红染色(2%乙酸,0.5%丽春红的水溶液)观察蛋白条带转移到膜上的效率。,转膜系统,Mini Trans-Blot cell components,聚丙烯酰胺胶-膜三明治,半干转 快速,约10-30min 湿转 较稳定,300 mA,1.5-2h,封闭,原理: 脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去
13、封闭膜,避免标记抗体固定在膜上引起背景增高,即脱脂奶粉中的蛋白通过疏水作用与膜上没有蛋白的部分结合,从而可以阻止一抗与膜通过疏水作用结合而产生很高的背景。 种类: 常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, gelatin, tween-20等,一般用non-fat milk. 实验步骤: 5%脱脂奶粉(用1x TBS配制,或1xTBST配制)封闭过夜 或室温12小时。 注意:奶粉封闭液最为物廉价美,但若牛奶中可能含有需western的蛋白时,则不能用其作为封闭液。,一抗、二抗孵育,1:原理: 一抗可以与要检测的蛋白特异结合,二
14、抗可与一抗结合,同时二抗上带有特异的酶(如辣根过氧化物酶HRP,碱性磷酸酶法AP,化学发光显色法HRP ),此酶可以分解底物使胶片感光。 2:实验步骤: 一抗孵育:5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度,与膜室温孵育1小时或4度过夜(抗体浓度及孵育时间需根据不同的抗体做相应调整, 1xTBST,洗膜3次,每次5分钟 二抗孵育:5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度,与膜室温孵育1小时, 1x TBST,洗膜3次,每次5分钟,显影,1、HRP-ECL发光法: 将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中,迅速盖上胶片,关闭胶盒,根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2m
15、in,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影,清水冲净晾干。 2、图片分析: 标定Marker,进行分析与扫描。,灰度分析,剪取条带 灰度分析 计算比值,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平? 凝胶漏液?,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀 温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,常见问题,提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径? 聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后
16、者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。 “ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因? 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。 处理办法:待其充分凝固再作后续实验。 “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因? 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。,为什么溴酚蓝不能起到指示作用? 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。 为什么电泳的条带很粗? 电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。 处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.8);适当降低电压; 电泳时间比正常要长? 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。,初学者常见问题,为什么电泳电压很高而电流却很低呢? 比