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1、Western blot 实验技术,曹 红 2012.11.15,定义：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。,Western blot 原理,Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋
2、白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。 由于Western blot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。,Western Blot 信号放大基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,底片扫描、分析,底物显色
3、,二抗孵育,一抗孵育,封闭,转膜,SDS-PAGE电泳,蛋白样品的制备,培养细胞：洗掉培养基，PBS洗23次，加入裂解液，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，超声波匀浆器匀浆，冰上静置30分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清. 组织样品：快速取材、液氮速冻、按每80毫克组织加1毫升的比例加入裂解液,超声波匀浆器匀浆，静置60分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清. 样品保存：避免反复冻融样品，EP管分装 -20度保存，不要超过2周，最长不要超过1个月；-80度（或-70度）保存，一般不超过半年，最多1年。 裂解液： Tris-HCl, EDTA, NP40 ， CHAPS, PMS
4、F ， protein inhibitor ,（磷酸酶抑制剂：氟化钠、钒酸钠）,蛋白样品的制备,BCA（bicinchoninic acid, 二辛可酸）法测定蛋白浓度,原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物， 在562nm除有高地光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 浓度检测范围：10 - 2000ug/ml 步骤：(1)标准品与待测样品稀释(至检测范围）；(2)与等体积WR工作液混合；(3) 37度反应2hr；(4)测定562nm处光密度(OD)值; (4)绘制标准曲线并计算蛋白浓度,SDS-PAGE（p
5、olyacrylamide gel electrophoresis, 聚丙烯酰胺凝胶电泳),原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应. SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS后後,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动
6、速率就只剩下分子大小一项因素。,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液（积层胶：PH=6.8；分离胶：PH=8.8） TEMED（四甲基己二酸），加速剂，催化APS产生自由基 过硫酸铵(现配现用)：产生自由基，并引发丙烯酰胺单体聚合 Tris-甘氨酸电泳缓冲液（PH=8.3）,凝胶成份,SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 不连续体系由电极缓冲液、凝胶（积层胶和分离胶）所组成。积层胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl。分离胶是由APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8 Tri
7、s-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，因而其分离条带清晰度及分辨率均较好。,凝胶浓度与蛋白分离范围,制备样品,样品缓冲液： 1）SDS：断裂分子内和分子间的氢键，取消蛋白质分子内的疏水作用，使分子去折叠，破换蛋白分子的二、三级结构；去除蛋白质电荷。 2）强还原剂：如beta巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇），能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 3）溴酚蓝：指示剂 步骤： 混匀、沸水煮5min， 4度离心，置冰上备用。 注意：处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1-
8、3分钟，以消除亚稳态聚合。,蛋白marker,NEB蛋白marker,Bio-rad彩虹marker,凝胶染色,标准考马斯亮蓝染色法 （1）电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)； （2）室温下振摇温育至过夜； （3）去除染色液，收集保存可重复使用20-40次； （4）依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白每条带。 注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热，（大约50-60），染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-
9、2h。,操作图示,注意事项,（1）所有蛋白样品定量一致，体积一致，不够的用裂解液补满，样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样，Marker也用1loading buffer调整至与样品等体积，这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散，使最边上的孔道电泳出现误差。 （2）Western Blot一般上样30100微克不等，结果跟目的蛋白的含量、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以调整。 （3）积层胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前
10、进入分离胶。而在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。 （4）pH对整个反应体系的影响是至关重要的，在SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是TrisHCL缓冲系统，积层胶是pH6.8，分离胶pH8.8；而电泳缓冲液使用的Tris甘氨酸缓冲系统，PH8.3,PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理： 一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差，背景相对较弱。 尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的
11、PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好，但背景相对较强。 分类： 半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。BIO-RAD的半干转运系统的弱点就是无法控温，当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。,转膜,转膜步骤,半干实验步骤： 先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s,在放入转膜缓冲液里浸泡数分钟。每块胶用60mA，1h，从下到上的顺序：阴极/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸, 凝胶面向
12、阴极，保持湿润和没有气泡。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。 湿转实验步骤： 将膜，凝胶放置到湿转夹子中，膜面向正极，凝胶面向负极，300 mA横流转膜1.5-2小时，时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进行相应调整，转膜后丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。,转膜系统,Mini Trans-Blot cell components,聚丙烯酰胺胶-膜三明治,半干转 快速，约10-30min 湿转 较稳定，300 mA，1.5-2h,封闭,原理： 脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去
13、封闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高，即脱脂奶粉中的蛋白通过疏水作用与膜上没有蛋白的部分结合，从而可以阻止一抗与膜通过疏水作用结合而产生很高的背景。 种类： 常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, gelatin, tween-20等,一般用non-fat milk. 实验步骤： 5%脱脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封闭过夜 或室温12小时。 注意：奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白时，则不能用其作为封闭液。,一抗、二抗孵育,1：原理： 一抗可以与要检测的蛋白特异结合，二
14、抗可与一抗结合，同时二抗上带有特异的酶（如辣根过氧化物酶HRP，碱性磷酸酶法AP,化学发光显色法HRP ),此酶可以分解底物使胶片感光。 2：实验步骤： 一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜（抗体浓度及孵育时间需根据不同的抗体做相应调整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分钟 二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时， 1x TBST,洗膜3次，每次5分钟,显影,1、HRP-ECL发光法： 将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2m
15、in，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。 2、图片分析： 标定Marker，进行分析与扫描。,灰度分析,剪取条带 灰度分析 计算比值,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,常见问题,提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后
16、者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 “ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.8）；适当降低电压； 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。,初学者常见问题,为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 比
