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1、cI|1007-3949(2011)19-06-0465-05 L小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定*,*(中南大学湘雅二医院心内科, 湖南省长沙市 410011)1oM内皮祖细胞;骨髓;小鼠K1建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞的方法。ZE通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增,诱导分化为内皮祖细胞。应用流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133。T经密度梯度离心和差速贴壁法分离所得的细胞经EBM-2专用培养基培养后,第 4天可见集落形成,培养第 12天流式细胞仪检测其CD34、
2、CD133、Flk-1、CD31的阳性率分别为 65%4%、48%3%、37%3%和 51%4%。从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞的方法效率高,稳定性和重复性好。ms|R34 DSM AIsolation, CultureandIdentificationofMouseBoneMarrow-derivedEndothelialProgenitorCelsLIMei-Ling, LIUFeng-Jiao, andLIULing(DepartmentofCardiology, theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity, Chang
3、sha, Hunan410011, China)KEYWORDSEndothelialProgenitorCells;BoneMarrow;MouseABSTRACTAimToestablishaneficientandstablemethodforisolation, cultureanddirectionaldifferentiationofendothelialprogenitorcellsfrommousebonemarrow.MethodsMononuclearcellswereisolatedfrommousebonemarrowbydensitygradientcentrifug
4、ationanddiferentialadhesionmethod.Theremainingcellswereculturedanddifferen-tiatedtoendothelialprogenitorcelsinEBM-2.Theexpressionsofspecificantigens(CD34, CD133,Flk-1andCD31)oncelsurfacewereanalyzedbyflowcytometer.ResultsCellswereobtainedfrommousebonemarrowbydensitygradi-entcentrifugationanddiferent
5、ialadhesionmethodformedclustersatday4.Atday12, positiveratiosofCD34+,CD133+, Flk-1+andCD31+were65%4%, 48%3%, 37%3%and51%4%, respectively.ConclusionAnefficient, stableandreplicablemethodforisolationandcultureofendothelialprogenitorcelsfrommousebonemar-rowhasbeenestablished.=C%(endothelialprogenitorce
6、ls, EPC)5=%-8%,V5%=%W%,99s?,V_53(F#?)tis=% 1 。EPC1i ,8C、Fs%y0、0Of/,VV _、B、s,35,53#5=。yN5%h、5#Z*,q,V3=,Z_y,E-。465CN43-1262/RS2011M1961ZE1.168周龄SPF级昆明雄性小鼠 24只,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。EBM-2 Sin-gleQuots购自瑞士Lonza公司;胎牛血清、牛脑垂体提取物购自美国GIBCO公司;人纤维连接蛋白(fi-bronectin, FN)、血管内皮生长因子(vascularendo-thelialgrowthfactor, VE
7、GF)购自美国RD公司;小鼠淋巴细胞分离液 Histopaque-1092购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;FITC-anti-mouseCD34及同型对照、FITC-anti-mouseCD133及同型对照、PE-anti-mouseCD31及同型对照、PE-anti-mouseFlk-1及同型对照购自美国Bioscience公司。1.2N!倒置荧光显微镜(NikonEclipseTE2000-s);BDBiosciencesFACSCaliburTMsystem流式细胞仪。1.3 %s昆明小鼠腹腔注射 0.2 mL肝素后再以 0.1 mL水合氯醛腹腔麻醉。在体积分数为 75%的乙醇中浸
8、泡 10min,无菌条件下剥离双下肢股骨和胫骨,剪去股骨和胫骨两端的骨骺,暴露骨髓腔。用1mL注射器吸取磷酸盐缓冲液(phosphatebuferedsolution,PBS)冲洗骨髓腔, 直至冲洗液清亮,骨髓腔变白,收集全部骨髓细胞于离心管,反复吹打以获得单细胞悬液。然后将骨髓单细胞悬液缓慢加于淋巴细胞分离液上,单细胞悬液与分离液的体积比为 21。常温下 2 000 r/min离心 25min,轻轻吸取离心管中间白色云雾状单个核细胞层,PBS洗涤细胞 1次,以洗净残余的淋巴细胞分离液。1.4%_=C%!参照文献的方法 7 ,提前 3 h10 mg/LFN包被25 cm2培养瓶。将收集的单个核
9、细胞加入 EBM-2完全培养液含体积分数20%的胎牛血清,VEGF10g/L,牛脑提取物 5 mg/L,表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)10g/L,碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)2 g/L,胰岛素样生长因子 2g/L重悬细胞, 反复轻柔吹打制成单细胞悬液后进行细胞计数。将小鼠的骨髓单个核细胞按(1.0 2.0)109/L密度接种于事先用FN包被的培养瓶中,置 37、体积分数为 5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。第 4天首次半量换液, 弃去悬浮细胞, 继续培养,以后每两天半量换液 1次。培养至 12天,
10、收集贴壁细胞供细胞鉴定。1.5=C%4用倒置荧光显微镜每日观察 EPC的生长增值情况及形态特征并拍照。1.6=C%Vk取培养到第 12天的原代EPC,以 0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenedinitrilotetraaceticacid,ED-TA)/PBS消化后用PBS重悬细胞,1%多聚甲醛 4固定 20 min,PBS洗 2次,光镜下计数。分别设立对照管1、2、3, 实验管1、2、3、4,每管加入 1105个细胞。对照管 1、2、3中分别加入同型对照抗体 FITCRatIgG2a、FITCRatIgG1、PERatIgG2a,实验管 1、2、3、4分别加入 FITC-ant
11、i-mouseCD34、FITC-anti-mouseCD133、PE-anti-mouseCD31、PE-anti-mouseFlk-1。4避光孵育 30 min,PBS洗 1次,PBS重悬,行流式细胞仪检测,分析 CD34+、CD133+、Flk-1+和CD31+细胞所占的百分率。1.7d9)实验数据以均数标准差(xs)表示。组间差异采用Studentt检验,双侧P0.05认为有统计学意义。2T2.1=C%8!#9s%l,%?us。 %24 hs%7SLC、Mv,A/LC%i9,iv%l,l。!4?LC%7S9,“”3,W%,H%,b_3(m1A)。67?%A9(m1B)。810?9F,iCH,V53。s%Bl,?LC,AH。2HvsEPC,%M,“F”(m1C)。2.2=C%kT%N_TAU,EPCCD34、CD133、Flk-1CD31qsY65%4%、48%3%、37%3%51%4%(n=3)(m2)。3)=C%5=%-8%,?%,V、 、#F。M、#F466 ISSN1007-3949 ChinJArterioscler,Vol19,No6,2011, cv%C%,EPCc,O9?。7O %18,Mf+,yNL4 %TEPC。-EPCsZE%LCsE#$CD34CD133FfHE。%LCsET,n,N1p,EPCB,7fHEVlBEPC,
