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1、无菌保证基本原理与实际应用 马涛,人员要求,足够的数量、适当资质、实践经验 书面的岗位工作职责 岗位职责不得遗漏、交叉的职责应有明确规定 个人承担的职责不应当过多 所有人员必须经过培训并考核 职责委托 人员卫生,-3-,前言,基本概念,药典和GMP对无菌保证水平的定义 系指无菌药品中存在活微生物的概率 最终灭菌产品：无菌保证水平不超过一百万分之一 非最终灭菌产品：以培养基灌装零污染为目标，实际污染率低于1/5000,-4-,药品达到法定标准的关键,三个关键方面 能充分杀灭污染微生物 已灭菌的产品不被再污染 消除带菌产品混入已灭菌产品的风险 三个核心问题 产品和灭菌工艺设计达标的基础 工程设计和
2、建设实现设计目标的硬件 日常的运作管理实现设计目标的软件,-5-,解决问题的钥匙,知识 无菌保证的理论 技能应用知识解决问题的能力 消除威胁无菌保证的潜在风险因素,-6-,-7-,第一部分 无菌保证基本原理,-8-,微生物基础常见微生物,-9-,微生物分布特点,气源性微生物革兰氏阳性菌较多 它们可形成芽孢 水源性则革兰氏阴性菌居多 不会形成芽孢，耐热性差 但会产生细菌内毒素,G+,G-,-10-,芽孢及其特点（一）,当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为保护自身，在细胞内形成一外壁厚而坚硬的休眠体，该休眠体即称芽孢（Spore）或孢子。 对不良环境如热、化学消毒剂的耐受性远高于生长态细胞 环境条
3、件适宜，恢复生长和繁殖,-11-,芽孢及其特点（二）,耐热 80 下长期存活 100 下有相当高的存活率 100 以上死亡过程符合一级动力学方程 影响芽孢耐热性的因素 芽孢存在的介质 受热时的湿度,-12-,热对微生物的作用,当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白质、酶及核酸时，细胞死亡。 实验证明微生物受热死亡速度符合一级动力学方程，简称对数规则,-13-,微生物存活数与灭菌时间关系图,半对数座标,Y轴：活微生物数量的对数 X轴：时间为10进制普通座标,-14-,芽孢的耐热参数：D值,指一定温度下将微生物杀灭90 或下降一个对数单位所需要的时间。,D=t2-t1 单位：分钟,-15-,灭菌温度对
4、D值的影响,灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长,-16-,F0值：达到同一灭菌效果的概念,F0值即标准灭菌时间 指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条件（121）相同灭菌效果的曝热时间,t1,t2,-17-,不同灭菌温度下的灭菌率,灭菌率：为达到与某一温度下灭菌1分钟相同的灭菌效果，在121下灭菌所需要的灭菌时 100灭菌时1分钟，相当于121 灭菌0.008分钟，即Fo值为0.008分钟 105灭菌40分钟时，Fo约为 1分钟，能使D值为1分钟的芽孢数量下降1个对数单位,-lgSAL F0/D lgN0 SAL: 无菌保证水平 N0:灭菌前微生物污染量,无菌保证水平与F0、D值及带菌量的
5、关系,-18-,-19-,灭菌过程的Fo 示意,-20-,“无菌”的标准及理论,“每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证明的。用无菌检查法显然是不可能的。 然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算的。 这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D值，使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。 量化指标 + 计算 + 试验，使无菌标准成为工业界可执行的标准,-21-,无菌保证水平举例,假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0）为100cfu/瓶，污染微生物的耐热参数（D）为1分钟，要达到药典规定的SAL的标准，灭菌F0值应达到多少？相当于121 和115 下灭
6、菌多少分钟？ 答：F0=（-lgSALlgN0）D =（6+ lg100）1= 8分钟，需在121下灭菌8分钟。 换算成115 下的灭菌时间是： F0 /L115=8/0.25=32分钟。,-22-,某复方氨基酸注射液采用110，30分钟的灭菌程序，起始污染微生物仍为100cfu/瓶，D值为0.5分钟，请计算无菌保证值和残存微生物污染的概率。 答：-lgSAL= F0/D - lgN0 = L110t /D - lg100 = 0.0830/0.5-2 = 2.8 残存微生物的概率SAL为10-2.80.00158 通过无菌检查的概率为(1-0.00158)20=0.969,无菌保证水平举例二
7、,-23-,第二部分 实际应用,灭菌工艺的选择欧盟灭菌工艺决策树,-24-,能否121，15分钟 湿热灭菌,121，15分钟湿热灭菌,是,否,能否采用F08的湿热灭菌，以达到SAL10-6,采用F08的湿热灭菌，以达到SAL10-6,是,否,能否对药液除菌过滤,药液除菌过滤及无菌灌封,无菌原料，无菌配制 无菌灌封,是,否,-25-,灭菌工艺与灭菌前微生物控制的关系,-26-,产品灭菌完全的必要措施,从公式 -lgSAL F0/D lgN0 看灭菌完全的必要措施 足够高的F0值 受控的产品灭菌前污染菌状况 需氧菌总计数（微生物污染水平） 污染菌耐热性,-27-,产品灭菌完全的必要措施-2,通常采
8、用的中间控制手段： 对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。 样品须作需氧菌总计数 将检品液置于100下加热15分钟左右，检查是否有耐热芽孢存活 须对微生物学检测结果进行趋势分析。,-28-,产品灭菌完全的必要措施-3,FDA要求 “ 对于在灭菌前产品污染菌检测中所发现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所用生物指示剂的耐热性进行对比”,-29-,产品灭菌完全的必要措施-4,具体要求： 如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将其培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证灭菌工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。 如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示剂的耐热性，则必须使用耐热性更强的
9、生物指示剂对灭菌工艺重新进行验证(可以使用生产中的分离菌)。 如果在生产全过程中，对微生物污染严格控制，那么，这种情况发生的概率是非常小的。,工程设计、建设与日常管理,灭菌前工艺设备与运行应关注微生物污染控制方面的风险 主要风险因素： 工艺设备设计与清洁、消毒方法 包装容器清洗设备设计与方法 洁净区及HVAC系统和操作人员行为 残留微生物在适宜的条件下繁殖 关键设备故障,-30-,微生物污染的风险控制（一）,风险管理措施（监控） 制定灭菌前微生物含量警戒、纠偏、合格标准 取样方法SOP：保证灭菌前微生物含量样品的代表性 样品应反映最差情况 年度质量回顾可反映整体状况,-31-,微生物污染的风险
10、控制（二）,管理措施（设备与容器的清洁与消毒） 设备的状态管理防止状态的混淆 经验证的清洁和消毒方法 清洁和消毒工艺关键参数：水温，清洁剂浓度，流速，时间，阀门的开闭，蒸汽温度，压力等 SOP应详细规定清洁和消毒的周期与有效期 包装材料清洗设备的功能和运行状况,-32-,微生物污染的风险控制（三）,管理措施（消除生产环境和人员造成的污染） HVAC系统设计应以生产工艺动态条件为基础 动态监控洁净区的环境 定期高效过滤器泄漏率测试 SOP规定发生诸如停电、通风系统故障、环境卫生状况超标等偏差后应采取的相应措施 洁净区清洁和人员行为规程,-33-,微生物污染的风险控制（四）,管理措施（工艺和关键设
11、备偏差） 控制各工艺步骤的时限 关键设备故障后的处理方法 发生偏差后增补灭菌前微生物含量样品,-34-,灭菌设备与运行,灭菌工艺对无菌保证有决定性的影响 特别关注灭菌设备的工艺适用性 灭菌设备和灭菌工艺的验证 灭菌设备的状态和维护 灭菌工序现场的管理,-35-,-36-,湿热灭菌,湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋式） 实际上只要微生物处于达到水水蒸气平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌 例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入1ml水并密封。,-37-,干热灭菌,干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似，符合“ 对数规则” ，但灭菌的机理却并不相同。 干热灭菌为何需较高
12、的温度？ 水份的影响：湿度低 机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而不是使蛋白质变性,-38-,干热灭菌,干热灭菌的介质通常是热空气 用对数规则描述微生物杀灭过程，准确性较差 温度高，200 以上 用于玻璃容器、手术器械等 无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和去热源,-39-,干热灭菌与去热原的关系,去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要苛刻得多，通常相当于标准干热灭菌时间FH 的数十倍。 如果干热法去热原工艺能使细菌内毒素下降3个对数单位，就不必再进行微生物的生物指示剂挑战性试验。,-40-,灭菌设备,混合蒸汽灭菌柜 下排式蒸汽灭菌柜 脉动真空蒸汽灭菌柜 喷淋式灭菌柜 水浴式灭菌柜 隧道式洗瓶灭菌柜工作
13、原理,灭菌设备核心关注点,足够的热均匀性 防止二次污染的设计 设备工作稳定可靠,-41-,-42-,混合蒸汽灭菌柜,混合汽体灭菌柜 顶上用一风扇，使灭菌均匀 无风扇时，灭菌容易不均匀,-43-,下排式蒸汽灭菌柜,热蒸汽在上 冷空气在下 蒸汽挤空气,-44-,脉动真空蒸汽灭菌柜,残存的空气越少，温度和压力的线性关系越好,密封圈,-45-,旋转喷淋灭菌柜,纯化水或注射用水作传热介质-过热水灭菌 加热时开工业蒸汽 冷却时，可用冷冻水或自来水冷却 产品转动，受热均匀 软袋灭菌时，用过热水较多，但需加压缩空气,-46-,干热灭菌柜,常见程序：1802小时，细菌内毒素下降3对数单位,-47-,隧道式洗瓶灭
14、菌柜工作原理图,瓶清洁,排水汽,预热,去热原,冷却,干热灭菌,层流 保护,洗瓶及灭菌、去热原为联动线,B区,-48-,灭菌设备与工艺的验证,设计确认 灭菌设备的设计首先必须满足灭菌工艺的要求 例如：假设121下灭菌8分钟，若热分布温差1，则Fo的波动范围达到6.3510分。对应残存概率灭菌工艺，热分布温差设计标准很重要 必须有防止二次污染的设计 多点控制反馈设计有利于设备运行稳定，可控,49,性能确认,空载热分布和满载热分布 目的：考察腔室装载区温度分布情况，找到冷点 合格标准：以被灭菌物品的无菌保证为出发点 冷点的标准应考虑灭菌工艺的风险。通常温差0.5 ，可认为无冷点。 温度采集系统的误差
15、应与其目的相适应,50,灭菌工艺验证热穿透试验,目的： 获取不同位置的产品在灭菌过程中实际达到的温度和F0值，了解不同位置的产品之间温度和F0值的差异，确定实际冷点。 获取产品内的温度和F0值与灭菌设备控制和记录的相应数据间的差异情况。,-51-,灭菌过程的Fo 示意,52,灭菌工艺验证热穿透试验,标准 制定原则：保证产品实际获得的温度和F0值符合注册标准。 实际情况：温度分布有差异，每次灭菌间有差异 引入标准偏差：产品内F0值平均值(13)SD符合注册标准 耐热物品灭菌：F0值远远大于12分钟，冷点处F0大于12分钟,灭菌工艺验证微生物挑战试验,目的 过度杀灭灭菌工艺：能确保杀灭所有污染微生
16、物，使产品中微生物存活概率不超过一百万分之一 残存概率灭菌工艺：证明在灭菌工艺能将符合灭菌前污染微生物数量和耐热性限度的产品中的微生物杀灭至存活概率不超过一百万分之一,-53-,-54-,热力灭菌常用生物指示剂,灭菌设备的状态和维护,关键仪表的校验 灭菌工艺再验证状态 设备工作日志、故障、修理、确认 设备变更管理 设备预修计划和实施 防止二次污染系统的日常检查方法与记录,-55-,灭菌现场管理,防止混淆的措施 灭菌过程中设备故障中止灭菌程序的管理措施,-56-,-57-,总 结,细菌芽孢死亡规律符合一级动力学方程 无菌检查有明显的局限性 药典规定最终灭菌产品的污染概率不超过百万分之一，即无菌保证水平SAL不超过10-6 -lgSAL F0/D lgN0 F0值标准灭菌时间 D值微生物耐热参数 N0灭菌开始前微生物污染数,-58-,总 结-续,FDA将湿热灭菌工艺分为二类： 过度杀灭法 Fo不小于1
