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1、(10)申请公布号 CN 103194400 A(43)申请公布日 2013.07.10CN103194400A*CN103194400A*(21)申请号 201310100330.3(22)申请日 2013.03.26CGMCC No.6822 2012.11.13C12N 1/18(2006.01)C12N 13/00(2006.01)C12N 15/01(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(71)申请人江南大学地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号(72)发明人李崎 王金晶 沈楠 李永仙刘春凤 朱林江 郑飞云 顾国贤(74)专利代理机构北京爱普纳杰专利代理
2、事务所(特殊普通合伙) 11419代理人何自刚 王玉松(54) 发明名称一种低产乙醛啤酒酵母及其驯养方法(57) 摘要本发明公开了一种低产乙醛啤酒酵母D-A-14（Saccharomyces cerevisiae D-A-14），于2012年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6822。该方法采用啤酒酵母为出发菌株，经紫外诱变后涂布于含有双硫仑的合成培养基上，从而筛选出低产乙醛啤酒酵母。筛选出的优选酵母再经乙醛培养基驯养一定的周期，可以使其代谢乙醛的能力加强、速度加快，具有重要的应用价值。(83
3、)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页(10)申请公布号 CN 103194400 ACN 103194400 A1/1页21.一种低产乙醛啤酒酵母D-A-14（Saccharomyces cerevisiae D-A-14），于2012年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6822。2.根据权利要求1所述的啤酒酵母，其特征在于所述酵母形状近似于圆形，直径大小介于2.0-3.5微米；在YPD
4、固体培养基表面生长48个小时后，即能长出大小约2-3毫米左右的菌落，菌落乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，质地均匀，半透明，易挑取，有酒香味。3.一种获得权利要求1所述低产乙醛啤酒酵母的方法，包括如下步骤：出发菌株经紫外诱变后，稀释涂布于双硫仑平板，挑取长出的菌落进行三角瓶发酵；产乙醛量较低的酵母进行进一步的乙醛液体培养基驯养，从而筛选出低产乙醛酵母。4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述双硫仑培养基组分如下：乙醇2%，双硫仑10M，琼脂2%，(NH4)2SO45g/l，KH2PO41g/l，NaCl0.1g/lMgSO47H2O0.5g/l，CaCl20.1g/l，酵母膏0.1g/l。5.权
5、利要求3所述的方法，其特征在于所述乙醛培养基组分如下：(NH4)2SO45g/l，KH2PO41g/l，NaCl0.1g/l，MgSO47H2O0.5g/l，CaCl20.1g/l，酵母膏0.1g/l，乙醛500mg/l。6.权利要求3所述的方法，其特征在于所述乙醛培养基的培养温度为11，以防乙醛挥发。权 利 要 求 书CN 103194400 A1/3页3一种低产乙醛啤酒酵母及其驯养方法 技术领域0001 本发明涉及一种啤酒酵母及其驯养的方法，特别是一种低产乙醛啤酒酵母及其驯养的方法。 背景技术0002 乙醛，啤酒中含量最高的挥发性醛，是啤酒生青味、烂苹果味的主要来源。当乙醛含量超过50mg
6、/L时，有无法下咽的刺激感；超过25mg/L时有强烈的刺激性和辛辣感及郁闷性口感；超过10mg/L时有不成熟的口感。成熟的优质啤酒的乙醛含量一般在38mg/L。乙醛是引起“上头”的物质之一，并具有致癌作用，国外学者对其致癌性和毒性已进行了大量的研究。此外，乙醛对微生物的生长也有影响，高浓度的乙醛将会抑制微生物发酵，而低浓度时则促进其发酵。因此，目前关于乙醛的研究重点是降低其在啤酒中的含量。 0003 乙醛在啤酒酿造过程中的生成途径包括生物途径和化学途径。其中，乙醛典型的生物代谢途径如下图所示。影响乙醛含量的关键酶有丙酮酸脱氢酶、乙醛脱氢酶及乙醇脱氢酶II等，对这些酶的认识是研究酵母代谢产生乙醛
7、的基础。乙醛形成的化学途径又可分为两种，第一种为丙氨酸的史垂克(Strecker)降解，是指在褐色反应过程中形成的的二羰基化合物与丙氨酸反应，产生比丙氨酸少一个碳原子的乙醛；第二种为氧化态的类黑精和多酚将乙醇氧化成乙醛。 0004 从酵母的代谢途径中，乙醛脱氢酶是乙醛代谢途径中的关键酶。而双硫仑是二乙二硫氨甲酯的二倍体，又称戒酒硫、酒畏等，可用作酒增敏药物，进行戒酒的治疗。它是乙醛脱氢酶的抑制剂之一，一定浓度的双硫仑能部分或全部抑制乙醛脱氢酶的活性，从而使乙醛不能氧化为乙酸。在以乙醇为唯一碳源的培养基中，乙酸一旦不能形成，酵母的代谢流就无法进行下去，酵母则不会生长。不同酵母菌株其分泌的乙醛脱氢
8、酶的水平的高低不同，对催化乙醛氧化的能力不同，最终表现在发酵产物中乙醛的终浓度有所差别。本发明利用双硫仑平板，使低水平的乙醛脱氢酶活性受到抑制，进而抑制相应酵母菌株的生长，而产酶水平相对较高的菌株由于酶活只受到部分抑制，可继续在双硫仑平板上生长代谢，由此可有效快速地选育得到低产乙醛的菌株。之后，利用乙醛培养基驯养酵母，通过在培养基中添加高浓度的乙醛，使酵母长期处在一个高乙醛浓度的环境中进化出较强的乙醛降解能力，使乙醛含量进一步低产，遗传性能更加稳定。 发明内容0005 本发明要解决的技术问题是提供一种低产乙醛酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2012年11月13日
9、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6822，保藏地址为北京市朝阳区中国科学院微生物研究所。 0006 所述酵母形状近似于圆形，直径大小介于2.0-3.5微米；在YPD固体培养基表面生长48个小时后，即能长出大小约2.3毫米左右的菌落，菌落乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，质地均匀，半透明，易挑取，有酒香味。 说 明 书CN 103194400 A2/3页40007 本发明还提供一种筛选获得低产乙醛啤酒酵母的方法，出发菌株经紫外诱变后，稀释涂布于双硫仑平板，挑取长出的菌落。 0008 双硫仑是乙醛脱氢酶的抑制剂，在含有双硫仑的以乙醇为唯一碳源的培养上，双
10、硫仑通过抑制乙醛脱氢酶的活性抑制酵母的生长，而酶活性相对较高的菌株因酶活只受到部分抑制能继续在双硫仑平板上生长。能产高活性乙醛脱氢酶的菌株，其代谢的乙醛可在该酶的作用下被快速地通过氧化的方式进行转化，因而终产物中的乙醛含量也会较低，由此可以筛选出低产乙醛的啤酒酵母。 0009 本发明中双硫仑培养基（乙醇为唯一碳源）组分如下： 0010 乙醇2% 双硫仑10M 琼脂2% (NH4)2SO45g/l KH2PO41g/l NaCl0.1g/l MgSO47H2O0.5g/l CaCl20.1g/l 酵母膏0.1g/l 0011 本发明对筛选到的菌株进行驯化，以期获得具有较好工业应用价值的菌株，将上
11、述获得的酿酒酵母通过一定时间的高浓度的乙醛压力的驯化，提高酵母自身转化乙醛的能力，使终产物中乙醛的浓度进一步降低。 0012 乙醛压力驯化的条件为： 0013 培养基（乙醛为唯一碳源）组分如下： 0014 (NH4)2SO45g/l KH2PO41g/l NaCl0.1g/l MgSO47H2O0.5g/l CaCl20.1g/l 酵母膏0.1g/l 乙醛200mg/l 0015 培养温度为11，以防乙醛挥发。 0016 本发明提供了一种低产乙醛的啤酒酵母，其发酵后乙醛含量可低达2.86mg/L，使用本发明提供的驯化方法，可以高效的驯化菌株，提高菌株稳定性。 具体实施方式0017 实施例1低产
12、乙醛啤酒酵母的获得 0018 分别以含双硫仑浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/L的培养基培养出发菌，只有双硫仑为3.5mg/L的培养基没有酵母长出，所以选取3.5mg/L为筛选低产乙醛酵母的抗性 浓度。 0019 以啤酒酵母（保藏编号为CGMCC NO.2448）为出发菌株，通过紫外线诱变（15W紫外灯，在30cm处对打散的酵母菌液进行不同时间的紫外照射27s），稀释涂布于双硫仑平板，挑取长出的菌落，依次编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9等。 0020 表1双硫仑抗性平板上挑出菌落的发酵情况 0021 说 明 书CN 103194400 A3/3页5002
13、2 注：表中仅部分数据，因篇幅有限部分数据未列出。 0023 表1中的菌株是出发酵母经紫外诱变后长于双硫仑培养基上的菌株，实验证明经双硫仑平板筛选的酵母均是乙醛含量降低的菌株，只是乙醛含量的降低幅度有高有低，需要进一步进行驯化。 0024 实施例2菌株的驯化 0025 将实施例1中得到的菌株置于一定浓度的以乙醛为唯一碳源的液体培养基中，每48-72h转接一次以保证乙醛的浓度，11培养14天。驯养后，进行三角瓶发酵，考察其乙醛含量。 0026 表2经乙醛培养基驯养后的酵母发酵情况 0027 0028 注：表中仅部分数据，因篇幅有限部分数据未列出。 0029 由表2可以看出，经乙醛培养基驯养的酵母乙醛下降率为89.5%,而且酵母乙醛含量下降 50%以上的占68.4%，从而证明乙醛培养基驯养酵母可以有效降低乙醛量。 0030 通过驯养后，获得一株极优的酿酒酵母D-A-14，其乙醛产量为2.86mg/L，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为：CGMCC No.6822，保藏地址为北京市朝阳区中国科学院微生物研究所。 说 明 书CN 103194400 A
