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1、The world leader in serving science -SNP/CNV，稀有稀有突突变，变，microRNA，基因表达，蛋白表达，基因表达，蛋白表达 从核酸到蛋白从核酸到蛋白赛默飞世尔实时荧光赛默飞世尔实时荧光定量定量PCR完整解决方案完整解决方案 了解不一样的了解不一样的qPCR技术技术 于洋于洋 博士博士 2016.8.3 2 Proprietary Multiple sample types or or or or PCR About 60 minutes Analysis (Actual genotyping data from crude lysate from w
2、hole blood) Genotyping made simple! + + TaqMan Sample-to-SNP 直接直接从原从原始样本完成始样本完成SNP基因分型基因分型 40 Proprietary Hatfield et al., 2005；Motti D 2012) microRNAs in pluripotency and reprogramming （Leonardo TR，2012） 疾病：疾病：microRNA与疾病和肿瘤发生发展相关，研究microRNA可以阐述疾病或肿瘤发生的生物学机理，发 现潜在的microRNA生物标志物。 原癌miRNA (He et al.
3、2005； Costinean et al. 2006； Volinia et al. 2006) 抑癌miRNA（ He et al. 2007 ； Yu et al. 2007 ） 脑肿瘤 (Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病 (Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病 (Poy et al. 2004; Jishy et al. 2011) 通过检测血清、血浆或其他体液的microRNA生物标志物，可以进行疾病或肿瘤的早期诊断以及判断预后。 （小细胞肺癌 Heegaard NH，2011，心肌梗死 Cheng Y，2010，
4、前列腺癌Brian D. Kelly ，2015, etc） ） miRNA的生物学功能的生物学功能 73 Proprietary & Confidential 常见的常见的microRNA检测平台检测平台 74 Proprietary & Confidential ThermoFisher microRNA研究完整解决方案研究完整解决方案 发现新发现新miRNA Sequencing by NGS (S5, S5 XL) miRNA分离分离 Recover All for FFPE sample mirVana kit MagMAX mirVana Total RNA Isolation K
5、it MicroRNA Cells- to-Ct kit miRNA检测检测 Affymetrix GeneChip miRNA array TaqMan miRNA assay TaqMan MicroRNA Arrays Taqman advanced microRNA assay Custom TaqMan small RNA assays miRNA功能分析功能分析 mirVana miRNA inhibitor mirVana miRNA mimic Taqman gene expression assay Taqman Protein Assay Protein Thermo sh
6、ift 75 Proprietary & Confidential Northern Blot（杂交法（杂交法） 操作繁琐 需大量样品 可检测动态范围低 错配杂交问题 Microarrays（芯片法（芯片法） 通量高 可检测动态范围较宽 需要大量样品 很难区分前体miRNA和成熟miRNA 对序列近似的miRNA分辨率差 Quantitative Real-Time PCR（定量实时PCR） 只需微量样品 非常宽的可测范围 高灵敏度, 高特异性 但是，如何设计合适的引物和探针呢？但是，如何设计合适的引物和探针呢？ TaqMan MicroRNA Assays 前体miRNA 成熟体 miRNA
7、 microRNA检测检测方方法法 76 Proprietary & Confidential miRNA RT primer Step 1: Stem-loop RT Step 2: Real-time PCR cDNA Forward primer Reverse primer F Q TaqMan probe 优点 1.能区分前体和成熟体，特异性高。 2.高灵敏度，仅需1-10 ng RNA。 3.动态范围宽，高低拷贝均能同时检测。 4.快速，仅需3小时即可得到定量结果。 TaqMan MicroRNA分析试剂盒分析试剂盒原原理理 组分： 1.RT primer 2.Forward pr
8、imer 3.Reverse primer 4.TaqMan probe 77 Proprietary & Confidential TaqMan定量金标准 特异性检测microRNA成熟体 总数超过23,000个，超过200个物种 即开即用，无须优化 提供Assay形式定制服务 适用于全系列ABI品牌荧光定量PCR平台 TaqMan MicroRNA分析试剂盒分析试剂盒 78 Proprietary & Confidential TaqMan MicroRNA分析试剂分析试剂盒盒实验流程实验流程 ThermoFisher Cloud Software Expression Suite Sof
9、tware 79 Proprietary & Confidential 中通量中通量microRNA的检测的检测miRNA array 快速、高效的miRNA检测方法，同时检测多达380个miRNA。 85 Proprietary & Confidential 提供定制服务提供定制服务 87 Proprietary & Confidential 如果需要更高的检测通量？如果需要更高的检测通量？ 88 Proprietary & Confidential TaqMan OpenArray miRNA Panels 宽广的覆盖度宽广的覆盖度 同时检测3个样本 每个样本检测多达750个miRNA 高
10、通量高通量 每个工作日（8小时）可检测36个样本 单个样本单个样本/ /miRNA检测成本更低检测成本更低 需需要要QuantStudio 12K仪器且配套仪器且配套OpenArray模块模块 Sample 1 Sample 2 Sample 3 91 Proprietary & Confidential Case Study 该研究发现，粪便中的miR-20a表达水平可以作为人结直肠癌的早期诊断标志物。miR- 20a的表达水平由的表达水平由Taqman microRNA assay来进行验证来进行验证。 Levels of faecal-based miR-20a Tumour locat
11、ion does not significantly alter faecal miR-20a levels Evaluation of the effects of antibiotics on faecal-based biomarker miR-20a 92 Proprietary & Confidential Case Study 该研究发现，miR-1233在急性肺栓塞病人血清中表达量明显升高，而且miR-1233的表达量升高可以明显 区别于急性心肌梗死，深静脉血栓等临床症状相似的急性病，为对症治疗提供依据。该研究使用TaqMan microRNA Array筛选出候选的miR-12
12、33，然后再使用针对该microRNA设计的Taqman microRNA Assay进行多时间点、多样本的验证，这也是microRNA研究的常见思路和流程。 93 Proprietary & Confidential Case Study 该研究发现，let-7g、miR-193a-5p及miR-27a在直肠癌组织，癌旁组织及正常人直肠组织中表达量相对稳定，可以 作为microRNA定量研究中的内参。这项研究也给了我们一个启示，在荧光定量PCR实验中，没有万能的通用内参 ，寻找合适的内参，本身就是研究的一部分。该研究采用了QuantStudio 12K及microRNA Openarray
13、panel进行筛 选，然后使用定制的microRNA低密度芯片进行后续的大样本量筛选，数据使用我们的免费分析软件（Expression Suite）进行分析。 95 Proprietary & Confidential 如果需要检测多个microRNA的表达量，每次都需 要进行特异性的反转录，对我来说比较麻烦。 我现在还不确定要检测的microRNA，但是想先 进行反转录以便cDNA能够长期保存，是否有什 么解决方案？ 96 Proprietary & Confidential TaqMan Advanced microRNA Assays 1. 采用通用引物进行反转录，一次反转录的产物可用于
14、所有microRNA的定量 检测，非常适合目标microRNA数目比较多的研究需求。 2. 包含预扩增步骤，检测灵敏度更高，可检测低至60个拷贝。 3. 起始样本量仅需1 ng总RNA或2微升从血清/血浆中提取的总RNA 97 Proprietary & Confidential 检测原理检测原理 101 Proprietary & Confidential 两种两种Taqman MicroRNA assay的比较的比较 Taqman microRNA assay Taqman advanced microRNA assay 说明 TaqMan MicroRNA Assay在反转录 过程中采用
15、特异性茎环引物，生成的 模板用于实时荧光定量PCR。 TaqMan Advanced miRNA Assay采用通用RT步 骤，简化了工作流程，并采用了通用预扩增步骤， 实现高灵敏度的实时荧光定量PCR检测。 反转录 发卡状miRNA特异性反转录引物 通用反转录引物 通量 适合1-10个靶点 适合超过10个靶点 覆盖度 超过200个种属；覆盖miRBase V.21 重点关注人miRNA；覆盖miRBase V.21 规格 可提供单管、低密度芯片以及 OpenArray 规格 目前仅提供单管规格 102 Proprietary & Confidential miRNA功能研究的基本策略功能研究
16、的基本策略 筛选筛选miRNA TaqMan miRNA array 杂交芯片杂交芯片/NGS 确认表达确认表达 量差异量差异 转染转染 靶基因功能研究靶基因功能研究 TaqMan gene expression assay TaqMan Protein Assay Protein Thermo Shift Loss-of-function Gain-of -function mimics Inhibitor 优化转染条件优化转染条件 电转电转试剂盒试剂盒 是否有表型变化是否有表型变化 预测靶基因预测靶基因 Bioinformatics TaqMan miRNA assay 112 Proprietary & Confidential 辨辨别和预测别和预测miRNA的靶基因的靶基因 Sanger miRNA Target Database http:/ww
