revertraaceqpcrrtkittoyobo说明书

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1、科研用 中文说明书 OSAKA JAPAN TOYOBO CO., LTD. Life Science Department PCR 东洋纺 就 选 ReverTra Ace qPCR RT Kit (Code No.FSQ-101) TSB-029 12-03 目 录 1 前言 .1 2 产品内容.2 3 其他必需品 .3 4 使用方法 4 5 相关操作步骤 5 6 常见问题 8 7 相关产品 9 【注意】 本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试 剂用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护 用品，安全操作。 【保存】 所有组分请均保存于 -20条件下。 1

2、 1 前言 ReverTra Ace qPCR RT Kit 是基于制作 Realtime PCR 用模板 cDNA 的 目的而开发的高效率且使用简单方便的逆转录反应试剂盒。本产品采用了本公 司高性能逆转录酶 ReverTra Ace 和作为 Realtime PCR 目的片段短链 cDNA 合成的最优化反应成分，能够高效率地合成适用于 Realtime PCR 的 cDNA 模 板。此外，本产品简化了试剂盒的构成并且拥有快速的反应操作的特点，能够 在短时间内简单方便地进行 cDNA 合成。 本产品的试剂盒内没有添附 Realtime PCR 试剂。关于 Realtime PCR 产品，推荐使

3、 用本公司的 Realtime PCR 用试剂 Realtime PCR Master Mix 系列。（详情请参考7 相关产品的内容）。 本产品特征 1 对应各种不同长度目标片段的高效率逆转录 ReverTra Ace qPCR RT Kit 采用了最适合于 Realtime PCR 用 cDNA 合 成的反应缓冲液， 和以最恰当比例混合的 Primer 混合液， 对于各种不同长度的 目标片段， 不用摸索条件就能够进行高效率的逆转录反应。 2 反应时间短、 操作简单方便 ReverTra Ace qPCR RT Kit 只需要15 分钟的逆转录反应， 就能够对各种 长度的目标片段进行高效率的逆

4、转录反应。 此外， 在 Realtime PCR 的过程中， 会自动清除抑制反应的残留 RNA， 无须另外进行 RNase H 处理。 3 提高了与 Realtime PCR 试剂的兼容性 ReverTra Ace qPCR RT Kit 采用了对于 Realtime PCR 反应体系的影响 程度最小的成分，即使在 PCR 反应中添加了最多 20% 液量的逆转录反应液， 也能表现出良好的反应曲线（已通过使用本公司的 Realtime PCR Master Mix 确认）。最适合用于表达量较少的 mRNA 的高灵敏度检测。 2 2 产品内容 本产品包含以下几种试剂，每 10l 反应体系可使用 2

5、00 次。 所有试剂请均保存在 -20条件下。 试剂名保存条件容量 5RT Buffer （Reaction Buffer+MgCl2+dNTPs） -20400l Enzyme Mix （ReverTra Ace reverse transcriptase +RNase Inhibitor） -20100l Primer Mix （Random Primer+Oligo(dT) Primer） -20100l Nuclease-free Water-201000l2 5RT Buffer 含有反应缓冲液、MgCl2、dNTPs 等 5 倍浓度的逆转录反应液 Buffer。溶 解时，可能会出现

6、白色沉淀，但不影响其品质。请使用振荡器等仪器使其混合 均匀，等完全溶解之后再使用。 Enzyme Mix 含有本公司高性能逆转录酶ReverTra Ace和RNase Inhibitor的混合酶液。 -20条件下不会冻结。 Primer Mix 含有 Random Primer 和 Oligo(dT) Primer 的混合引物，以最恰当的比例 混合，对于各种不同长度的目标片段都能进行高效率的逆转录反应。 Nuclease-free Water Nuclease-free 级别的灭菌蒸馏水。为避免影响聚合酶的活性，未经过 DEPC 处理。 3 3 其他必需品 除本产品之外，请再准备以下几种试剂和

7、仪器。 Thermal cycler 和 Incubator 本产品的建议使用温度为 37、 98、 以及 65， 请准备好符合条件的相 关仪器。 Nuclease-free Water 本产品已添附可使用 200 次的 Nuclease-free Water， 此外请再准备一些 Nuclease-free Water， 以便在稀释模板 RNA 时使用。 推荐使用未经过 DEPC 处理的 Nuclease-free Water。 也可以使用经 DEPC 处理过的水， 但残留的 DEPC 会抑制反应的进行， 因此请使用高压灭菌器彻底清除 DEPC 之后再使 用。 此外， 为防止核酸的混入， 用于

8、逆转录反应和 PCR 反应的 Nuclease-free Water， 建议和用于其它实验的 Nuclease-free Water 分开保存， 避免共用。 Total RNA 使用本产品， 可以把 Total RNA 直接作为模板使用。 从组织、 培养细胞等得 到 Total RNA 中， 作为表达分析对象的 mRNA 的含量通常为 1-2%。 除了进行 检测表达量极低的目的基因之外， 通常情况下都可以明显地检测到作为模板的 Total RNA。 通过 AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform) 法等提纯的 Total RNA 中， 混有基因组 DNA。 对

9、于在检测的目的基因中存在很多假基因的情况， 以及 跨内含子位置不能设计引物的情况， 可能是因为由混入的基因组 DNA 产生的 假阳性信号引起的。 请采取必要的措施 （如： DNase I 等） 清除基因组 DNA。 poly(A)+ RNA(mRNA) 利用 poly(A)+ RNA 和 Oligo(dT) 杂交后，选择性地分离出仅有 poly(A)+ 末端的 mRNA。在提纯过程中浓缩 mRNA， 是为了在高灵敏度下能够检测 mRNA。 但是， 与 Total RNA 相比 mRNA 更容易受到 RNase 的分解， 也不能以 ribosomal RNA 为内参来进行相对定量。 4 4 使用

10、方法 （1）RNA 的变性 把 RNA 在 65条件下进行 5 分钟后，立即放于冰上冷却。 在经过以上步骤的处理后， 对于容易形成高级结构的 RNA可以提高逆转录的效率。 在进行以上步骤处理的时候， 请不要添加 5RT Buffer 和酶。 （2）反应液的配制 反应液组成 Nuclease-free Waterup to 10 l 5RT Buffer2 l RT Enzyme Mix0.5 l Primer Mix0.5 l RNA0.5pg-1 g Total volume10 l 除了在本试剂盒内添附的 Primer Mix 之外， 也可以使用基因特异性引物 （Gene Specifi

11、c Primer） 。 此时， 在反应体系中添加的最终浓度为 0.5pmol/ l（每 10 l 反 应体系添加 5pmol） 。 （3）逆转录反应 在 37条件下， 进行 15 分钟的逆转录反应。 在 98条件下， 进行 5 分钟的酶失活反应。 反应结束之后， 请保存于 4或者 -20条件下。 在进行 Realtime PCR 反 应时， 请在作为模板的反应液内直接添加或者稀释之后添加。 此温度条件是最适合本试剂盒组成成分的条件，一旦改变此温度条件，除了影 响酶的活性之外，对引物的退火效率、RNA 的清除效率、以及逆转录反应后的 酶失活效率等也会产生很大的影响。摸索条件的时候，请一定要基于此

12、温度条 件来进行实验。 把逆转录反应液添加到 Realtime PCR 反应液内时， 请不要超过 20% 的量。 添加 过量的逆转录反应液， 会降低 PCR 的反应效率， 不能进行准确的定量。 在使用基因特异性引物的情况下，特别是使用相同序列的逆转录引物和 PCR 引 物的时候，在逆转录反应时的非特异性退火是导致 PCR 非特异性扩增产物产生 的原因。此时，提高逆转录反应的温度（至 42-50） 可得到改善。 5 5 相关操作步骤 1 Total RNA 的 DNase I 处理 在通过 AGPC 法等提纯的 Total RNA 内混有基因组 DNA，可能会发生由 基因组 DNA 产生假阳性信

13、号的情况（请参考 p3），请根据以下的方法清除基 因组 DNA。 （1）反应液的配制和反应 反应液组成（例） Nuclease-free Waterup to 10 l Total RNA（10 g）X l 10DNase I Buffer1 l （10mM Tris-Cl, pH7.6, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2） RNase-free DNase I（10U/ l）0.5 l Total volume10 l 配制好以上的反应混合液后， 置于冰上反应1030 分钟。 （2）提纯（可使用一般的提纯试剂盒） 在反应液内添加 100 l 的 Nuclease-free W

14、ater、 100 l 的 TE 饱和苯酚， 用 vortex 使其充分混合后， 置于冰上 5 分钟。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 回收上清液。 添加 100 l 的氯仿后使其混合。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 回收上清液。 添加 100 l 的 5M 醋酸铵、 200 l 的异丙醇， 使其混合后置于 -20条件下 30 分钟。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 弃上清液。 在沉淀中加入 70% 乙醇。 12,000rpm、 5 分钟的离心后， 弃上清液。 在沉淀中加入适量的 Nuclease-free Water， 使其溶解。 6 2 Poly(A)+ R

15、NA 提纯法 在进行检测表达量较少的遗传基因时， 从Total RNA 中提取 poly(A)+ RNA 作为模板使用， 可以提高灵敏度。 在此介绍一个 poly(A)+ RNA 提纯法的例子： 通过使用 Oligo(dT) 结合磁珠的专用提纯试剂盒 MagExtractor -mRNA- （Code No. NPK-801） 的方法。 （1）DNase I 反应液的配制和提纯前的处理 反应液组成（例） MagExtractor -mRNA- 溶出液up to 100 l Total RNA（100 g）X l 10DNase I Buffer10 l RNase-free DNase I（1

16、0U/ l）1 l Total volume100 l 配制好以上的反应混合液后， 置于冰上反应15 分钟。 在反应液内添加 400 l 的溶解液 （含 2- 巯基乙醇） 和 800 l 的吸附液。 （2）反应和提纯 在新的 1.5ml 离心管内加入 250 l 磁珠。 使用磁力架 Magical Trapper （Code No.MGS-101） 或离心机等进行固液 分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。 添加上述经过事先处理的 Total RNA 液。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 后， 在室温下放置 10 分钟。 进行固液分离 （B/F 分离） 后， 弃上清液。 添加 1ml 的洗净液。 用 vortex 充分搅拌 （至均匀程度） 。 进行固液分离 （B/F