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1、拉曼光谱技术在植物细胞壁研究 中的应用以及展望,细胞生物学 2014年4月8日,2,目录,一、维管形成层及木质部细胞细胞壁概述 二、拉曼光谱技术原理及可用于研究植物细胞壁的拉曼显微技术 三、如何利用拉曼光谱技术研究植物细胞壁,截至 2010年，全世界石油储藏量为 13830亿桶，日消耗量为 8740万桶；天然气储量为 187.1万亿立方米，年消耗量为 3.1万亿立方米；煤炭储量为 8600亿吨，年消耗量为 72.7亿吨（statistical review of world energy full report 2011）。不断增加的能源消耗量使石油，天然气和煤炭资源在 最多43 年，62 年
2、和 120 年后将枯竭。 世界靠科技、工具与能源来改变，工业革命、科技革命和信息革命都改变了世界格局，当今的世界格局是西方掌握的先进科技与发达信息以及石油、天然气的分布划分而成的。而下一场能源革命已经悄悄在美国和加拿大展开 页岩气！美国已经拥有了生产页岩气的技术与批量生产的能力，五年之后就将生产出足以替代石油的新型清洁能源，加上美国国内的石油与天然气开发也逐步启动，二战后按石油储藏与生产、使用来划分的世界格局即将破局，中东的地位大幅下降，甚至会沦为一个乱摊子；俄罗斯靠出口石油的经济将会一蹶不振。互联网大数据时代让世界从此没有孤岛，能源革命直接决定世界的未来！ 仅仅是页岩气革命么？不！核能不可再
3、生而且存在风险，太阳能，风能，地热能，尤其是生物质能植物利用太阳能，通过碳同化的过程将吸收的二氧化碳转变为有机物，储存于植物体内。生物质能的形成过程由植物体自身完成，同时消耗掉大气中的二氧化碳，维持大气平衡。同时全世界范围内生物质资源总量十分丰富。木材是人们利用生物质能源的主要形式。木材即植物的次生木质部，它由木本植物的一种侧生分生组织维管形成层活动而 产生，因此对维管形成层发育与遗传调控的研究是使人们了解木材形成，提高木材产量和利用率的基础。,要解决的问题,木材形成与形成层的活动紧密相连 木材的次生木质部是形成层细胞分裂形成的,形成层在活动期内的活动变化不仅影响着木质部细胞形成的数量,同时决
4、定着木材的构造和其物理化学性能。 形成层紡錘形细胞是如何分化出各种类型样式的木质部细胞? 分化出来的木质部细胞是怎么生长的,其在发育过程中会发生什么的变化?而这些变化又与什么因素有关? 从细胞生物学和解剖形态学的水平来看，木材生长发育形成过程中细胞形态结构发生了哪些变化？ 在细胞水平和组织水平上来说，木材生长过程中发生了哪些细胞力学性质和化学成分分布的变化？ 这些问题,对于实现木材性质的改良和定向培育提供重要的理论依据。,1.1 木质部细胞的细胞壁结构,胞间层(intercellular layer) 细胞胞间层(intercellular layer)在分裂时，最初形成的一层是由果胶质组成的
5、细胞板(cell plate)，它把两个子细胞分开，这层就是胞间层，又称中层(middle lamella)。 初生壁(primary wall) 随着子细胞的生长，原生质向外分泌纤维素，纤维素定向地交织成网状，而后分泌的半纤维素、果胶以及结构蛋白填充在网眼之间，形成质地柔软的初生壁。 次生壁(secondary wall) 很多细胞只有初生壁，如分生组织细胞、胚乳细胞等。但是，某些特化的细胞，例如纤维细胞、管胞、导管等在生长接近定型时，在初生壁内侧沉积纤维素、木质素等次生壁物质，且层与层之间经纬交错。由于次生壁质地的厚薄与形状的差别，分化出不同的细胞，如薄壁细胞、厚壁细胞、石细胞等. 形成层
6、细胞分化为未成熟木质部细胞，未成熟木质部细胞继续分化。其中包括细胞壁沉积的重要过程,ML 胞间层；CW1 初生壁；S1 次生壁外层； S2 次生壁中层； S3 次生壁内层,构成细胞壁的成分中，多糖，蛋白质、酶类以及脂肪酸等 细胞壁中的多糖主要是纤维素、半纤维素和果胶类 纤维素构成微团，微团组成微纤丝，微纤丝再组成大纤丝，构成细胞壁支架 次生细胞壁中还有大量木质素,1.2 细胞壁结构成分,1.3 细胞壁形成,细胞壁的形成是多种细胞器配合作用的结果。 新细胞壁的形成开始于细胞分裂的晚后期或早期。 细胞分裂时，在母细胞的赤道板面上，分泌囊泡(secretory vesicles)不规则地汇聚在一块，
7、逐渐整齐地排列成片，组成成膜体(phragmoplast)。成膜体中的囊泡膜相互融合与连接形成细胞的质膜，其中的内含物连成一体构成细胞板，这是雏形的中层结构。 细胞板组成后，高尔基体小泡运输造壁物质释放到质膜外，以充实新形成的壁。当细胞板中逐渐有果胶质和少量纤维素分子不断地填充和掺入时便构成了中层，在中层两侧陆续有纤维素和半纤维素等物质的沉积则形成了质地柔软的初生壁，这时两个子细胞便形成。 此后，大多数细胞的初生壁内侧又分层、定向地沉积着纤维素分子，它们经纬分明地交叉加固，这是增强植物体支持能力的重要基础。纤维素分子的定向分层沉积与微管的活动有关，秋水仙素(colchicine)可阻止微管的形
8、成，抑制纤维素分子的定向排列。 微管的另一个重要作用是使新形成的细胞板上保留某些通道，参与胞间连丝的形成，使原生质在两个子细胞间能保持联系。,1.4 胞间连丝,当细胞板尚未完全形成时，内质网的片段或分支，以及部分的原生质丝(约400nm)留在未完全合并的成膜体中的小囊泡之间，以后便成为两个子细胞的管状联络孔道，这种穿越细胞壁、连接相邻细胞原生质(体)的管状通道被称为胞间连丝(plasmodesma)。 胞间连丝的数量和分布与细胞的类型，所处的相对位置和细胞的生理功能密切相关。 胞间连丝的功能：物质交换&信号传递,1.5 细胞壁的功能,对于细胞壁的功能，目前较肯定的有以下几个方面： 维持细胞形状
9、，控制细胞生长 细胞壁增加了细胞的机械强度，并承受着内部原生质体由于液泡吸水而产生的膨压，从而使细胞具有一定的形状，这不仅有保护原生质体的作用，而且维持了器官与植株的固有形态。另外，细胞壁控制着细胞的生长，因为细胞要扩大和伸长的前提是要使细胞壁松驰和不可逆伸展。 物质运输与信息传递 细胞壁允许离子、多糖等小分子和低分子量的蛋白质通过，而将大分子或微生物等阻于其外。因此，细胞壁参与了物质运输、降低蒸腾作用、防止水分损失(次生壁、表面的蜡质等)、植物水势调节等一系列生理活动。细胞壁上纹孔或胞间连丝的大小受细胞生理年龄和代谢活动强弱的影响，故细胞壁对细胞间物质的运输具有调节作用。另外，细胞壁也是化学
10、信号(激素、生长调节剂等)、物理信号(电波、压力等)传递的介质与通路。 防御与抗性 细胞壁中一些寡糖片段能诱导植保素（phytoalexin）的形成，它们还对其它生理过程有调节作用，这种具有调节活性的寡糖片断称为寡糖素(oligosaccharin)。,光谱分类,发射光谱,原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS）、X射线荧光光谱法（XFS）、分子荧光光谱法（MFS）等,吸收光谱,紫外可见光法（UV-Vis）、原子吸收光谱（AAS）、红外观光谱（IR）、核磁共振（NMR）等,联合散射 光谱,拉曼散射光谱（Raman）,2 拉曼光谱技术,1923年，德国物理学家A.Smekal从理论上预言了
11、光的非弹性散射的存在。 （A. Smekal，Nature 11 (1923) 873） 1928年，印度物理学家C. V. Raman在用汞灯的单色光来照射CCl4液体时，在液体的散射光中观测到了频率低于入射光频率的新谱线。在拉曼等人宣布了他们的发现的几个月后，苏联物理学家兰德斯别尔格等也独立地报道了晶体中的这种效应的存在。（C.V. Raman, K.S. Krishman, Nature 121(1928) 501） 光照射到物质上时会发生非弹性散射，散射光中除有与激发光波长相同的弹性成分（瑞利散射）外，还有比激发光波长长的和短的成分，后一现象统称为拉曼（Raman）效应。,2.1拉曼散
12、射效应的发现,从理论到技术拉曼散射效应的进展 1928年，印度物理学家拉曼（C.V.Raman）首次发现拉曼散射效应，荣获1930年的诺贝尔物理学奖，拉曼也成为自然科学亚洲诺奖第一人。 1928-1940年，拉曼光谱成为研究分子结构的主要手段。因为拉曼光谱频率及强度、偏振等标志着散射物质的性质。从这些资料可以导出物质结构及物质组成成分的知识。这就是拉曼光谱具有广泛应用的原因。 1940-1960年，拉曼光谱的地位一落千丈。主要是因为拉曼效应太弱（约为入射光强的10-6），并要求被测样品的体积必须足够大、无色、无尘埃、无荧光等。40年代中期，红外技术的进步和商品化更使拉曼光谱的应用一度衰落。（原
13、始的拉曼光谱以汞弧灯为光源,用常规摄谱仪做色散系统,出现的谱线极其微弱,限制了拉曼光谱的发展。） 1960年以后，激光技术的发展使拉曼技术得以复兴。由于激光束的高亮度、方向性和偏振性等优点，成为拉曼光谱的理想光源。而过滤器的发展过滤掉瑞利散射，计算机技术的发展使大数据分析成为可能。随探测技术的改进和对被测样品要求的降低，目前在物理、化学、生物、工业等各个领域拉曼光谱得到了广泛的应用，越来越受研究者的重视。并且形成了一门光谱学的分支拉曼光谱学。 重要学术会议： 国际拉曼光谱学大会(Thelnternational Confer-enceon Raman Spectroscopy,ICORS),2
14、.2拉曼(Raman)光谱基本原理,透射光,入射光,散射光,散射是光子与分子发生碰撞的结果,拉曼光谱是研究分子和光相互作用的散射光的频率,瑞利（rayleigh）散射： 弹性碰撞；无能量交换，仅改变方向； 拉曼（raman）散射： 非弹性碰撞；方向改变且有能量交换；,Rayleigh散射,Raman散射,E0基态， E1振动激发态； E0 + h0 ， E1 + h0 激发虚态； 获得能量后，跃迁到激发虚态.,Raman散射: Raman散射的两种跃迁能量差： E=h(0 - ) 产生stokes线；强；基态分子多； E=h(0 + ) 产生anti-stokes线；弱； Raman位移： R
15、aman散射光与入射光频率差；,CCl4的拉曼光谱,斯托克斯线和反斯托克斯线统称为拉曼谱线。由于在通常情况下，分子绝大多数处于振动能级基态，所以斯托克斯线的强度远远强于反斯托克斯线。,/cm-1,拉曼位移（Raman shift）,v即散射光频率与激发光频之差。 由于拉曼位移v只取决于散射分子的结构而与vo无关，所以拉曼光谱可以作为分子振动能级的指纹光谱。,适用于分子结构分析,与入射光波长无关,拉曼是指纹光谱,ni = no-n (cm-1),500 1000 1500 2000 2500 3000 3500,20000 15000 10000 5000 0,Intensity (A.U.),
16、OH stretching,CH3 Stretching Modes,Skeletal Bending,CCO modes,OH Bending,CH3 and CH2 Bending Modes,甲醇vs. 乙醇 CH3OH vs. CH3CH2OH,对不同物质Raman 位移不同； 对同一物质与入射光频率无关；是表征分子振-转能级的特征物理量；是定性与结构分析的依据； 拉曼线对称地发布在瑞利线两侧，长波一侧为斯托克斯线，短波一侧为反斯托克斯线； 斯托克斯线强度比反斯托克斯线强,2.3拉曼光谱的特征,2.4拉曼光谱技术在植物学研究中的优势,分辨率高（at the micrometer level ;0.5um） 由于激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,所以,常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。 而且,拉曼显微镜物镜可以将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小,因此可分析更小体积的样品。 非损伤性测量（比如超
