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1、专题一基因工程,第二节基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,例如：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、植物抗病基因等,1、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,（2）利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应
2、是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术使其数量呈指数方式增加，可获取大量的目的基因。,PCR技术,原理： 前提： 原料： 方式,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,一段已知目的基因的核苷酸序列（模板DNA） DNA引物； 四种脱氧核苷酸； 热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,逆转录法,目的基因的信使RNA,双链DNA（目的基因),化学合成法,蛋白质的氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,人工合成,逆转录酶,3、人工合成目的基因,推测,推测,单链DNA,DNA聚合酶,a、使目的基因在受体细胞中稳定存
3、在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,二、基因表达载体的构建核心,2，基因表达载体的组成：,目的基因+启动子+终止子+标记基因,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、酵母菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,(三)将目的基因导入受体细胞,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法, 感受态细胞吸收DNA分子,(三)将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,2、将目的基因导入动物细胞 方法
4、：显微注射法,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,【典型例题1】目的基因的获取及基因表达载体的构建,(2015重庆，6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( ) A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝
5、细胞mRNA反转录获得 B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点 C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用,C,点拨：表达载体的复制启动于复制起点，胰岛素基因的表达启动于启动子；抗生素抗性基因是标记基因，可用于筛选含胰岛素基因的受体细胞；启动子在转录过程中起作用，终止密码子在翻译过程中起作用,【方法点拨】基因表达载体中启动子、终止子的来源,(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。,(
6、2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。,【典型例题2】基因工程的操作程序,（2016海南卷.31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题： （1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即_和从_中分离。 （2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是_ 。 _ 。 （
7、3）在基因表达载体中，启动子是_ 聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是_。 （4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_ 和_ 颗粒。,人工合成,生物材料,cDNA文库中只含有叶细胞已转录的基因，,而基因组文库中含有该植物的全部基因,RNA,大肠杆菌,金粉,钨粉,【典型例题3】基因工程中的几种检测方法,(2014广东，25)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是(多选)( ),A.过程需使用逆(反)转录酶 B.过程需使用解旋酶和PCR获取目的基因 C.过程使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备 D.过程可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞,AD,【方法点拨】基因工程中的几种检测方法,
