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1、雌激素受体在甲状腺乳头状癌发病中作用的 实验研究 E x p e r i m e n t a ls t u d i e so f t h er o l e so f e s t r o g e nr e c e p t o r si n t h e p a t h o g e n e s i so fp a p i l l a r yt h y r o i dc a r c i n o m a 导师：张浩 论文课题起止时间：至Q ! Q 生! 旦二2Q12 生12 屋 论文完成n , - t 问： 至Q ! 兰生三月 中国医科大学( 辽宁) 2013 年5 月 中国医科大学研究生学位论文独创性
2、声明JF I I I IIl lI l ll l l l l l f l l f I r l l l r Y 2 2 9 7 3 5 7 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 兰盔叁日期： o | 弓；11 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书
3、本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期：一兰! 丛：! ：ff 这绪 一 目录 一、摘要 中文摘要1 英文摘要7 二、英文缩略语1 4 三、论文 论文一 前言。15刖舌 实验
4、材料与方法1 6 结果2 0 讨论2 4 结论2 6 参考文献2 8 论文二 诗 言3 1 一刚吾 实验材料与方法31 结果4 1 讨论4 6 结论4 7 参考文献4 8 四、本研究创新性的自我评价”5 0 五、附录 综j 态5l 在学期间科研成绩6 0 致谢6 1 个人简历6 2 中文论著摘要一 雌激素受体叭I l l 和p 2 在生育期甲状腺乳头状癌患者 中的表达及其意义探讨 目的 甲状腺乳头状癌( P T C ) 的发病率存在明显性别差异，女性的发病率可高达 男性5 - 6 倍，且生育期女性高发，绝经期后下降。这种性别差异表明P T C 的发生 和发展可能受女性激素，特别是雌激素的影响。
5、已有研究报道，雌激素影响P T C 细胞的生长，且雌激素主要通过与特定的雌激素受体( E R ) 结合而发挥生物学效 应。E R 主要有二种亚型E R n 和E R l 3 。最近发现E R p 存在5 种剪接变异体： E R 3 1 E R 1 5 ，E R p l 是野生型E R l 3 。目前除了野生型E R a 和E R p 有较多的报道之 外，E R f l 2 在P T C 发生和发展过程中的作用不清楚。6 7 是一个较理想的反映肿 瘤细胞增殖活性的标志物，突变型p 5 3 为肿瘤促进因子，V E G F 是一种重要的促 血管生成蛋白。为此，我们拟利用免疫组织化学方法检测生育期P
6、T C 和结节性甲 状腺肿( 结甲) 患者肿瘤组织中E R a 、E R l 3 1 和E R l 3 2 及上述分子标志物的表达， 以探讨其临床和生物学意义。 方法 选取我院病理科2 0 0 7 年“ - 一2 0 1 0 年临床资料完整的9 7 例患者的存档蜡块，其 中P T C6 7 例( 不包括微小癌) ，结甲3 0 例。P T C 患者病程均在3 年内，并且首诊 和治疗均在我院，依病情接受标准的手术治疗及术后甲状腺素( L T 4 ) 抑制治疗 和或放射性碘治疗，均无颈部放射史或甲癌家族史。通过查阅我院病案室病志， 进一步获取这些患者的性别、年龄、肿瘤大小( S i z e ) 、肿
7、瘤腺外侵犯( e x t r a t h y r o i d a l e x t e n s i o n , E T E ，指甲状腺癌侵入邻近组织或甲状腺峡部外的骨骼肌) 、淋巴结转移 ( 1 y m p hn o d em e t a s t a s e s ，L N M ) 、肿瘤T N M 分期( 依据美国癌症联合委员会 ( A J C C ) ) 等相关临床资料。在6 7 例P T C 患者中，生育期( 年龄1 8 4 5 岁) 女性 5 0 例、男性1 7 例。结甲患者3 0 例，均为生育期女性，病程在3 年内，作为甲状 腺良性病变对照组。应用改良的E l i v i s i o n
8、 T Mp l u s 二步法检测E R a 、E R p l 、E R l 3 2 和飚6 7 、突变型p 5 3 、V E G F 在6 7 例P T C 和3 0 例结甲组织中的表达。应用S P S S 1 6 0 软件处理和分析数据。以P 2 e m ，但_ 4 c m 局限于甲状腺内或任何肿瘤伴有最小限度的甲状腺外侵 犯( 如：胸骨甲状肌或甲状腺周围软组织) T 4 a 任何大小的肿瘤侵扩展出甲状腺包膜侵犯皮下软组织、喉、气管、食管 或喉反神经 T 4 b 肿瘤侵犯椎前筋膜或包绕颈动脉或纵隔血管区域淋巴结( R e g i o n a l L y m p hN o d e s ，N
9、) 1 7 N O 无区域淋巴结转移 N 1 区域淋巴结转移 N l a V I 区转移( 气管前、气管旁和喉I j ；f D e l p h i a 淋巴结) N l b 转移至单侧、双侧或对侧颈部或上纵隔淋巴结 远处转移( D i s t a n tM e t a s t a s i s ，M ) M 0 无远处转移；M 1 有远处转移 美国癌症联合委员会甲状腺乳头状癌临床分级标准 4 5 岁以下 I 期任何T 任何N M 0 ；I I 期任何T 任何N M l 4 5 岁或4 5 岁以上 二、方法 ( 一) 免疫组化步骤( E l i V i s i o n 两步法) 1 8 1 、将石
10、蜡包埋的标本制成4 岬厚的组织切片，切片后立即至于6 0 “ C 烤片机 烤片3 0 r a i n 到6 0 m i n 以利于标本与玻片紧密粘附。 2 、石蜡切片脱蜡至水：二甲苯中脱蜡( 二甲苯I ，二甲苯I I 各1 0m i n ) ，梯 度酒精中水化( 1 0 0 I 、I I 各1 0r a i n ，9 5 、9 0 、8 0 、7 0 酒精各5m i n ) 。 3 、蒸馏水洗涤切片3 x 3m i n 。 4 、抗原修复：置枸橼酸缓冲液中，经微波高火修复4m i n ，保温2 m i n ，然后 加热2 5 s ，保温2 m i n ，反复7 次，室温冷却。 5 、灭活内源性
11、过氧化物酶活性：石蜡切片放入3 过氧化氢中，室温灭活1 0 r a i n ，蒸馏水洗两次。 6 、滴加一抗，湿盒中孵育，4 。C 过夜。 7 、复温2 0 m i n ，P B S 洗3 x 3m i n 。 8 、滴加试剂A ，室温3 0r a i n ，P B S 洗3 x 3r a i n 。 9 、滴加试剂B ，室温2 0m i n ，P B S 洗4 x 5m i n 。 1 0 、D A B 显色，显微镜下观察一自来水冲洗，终止反应。 1 1 、苏木素复染4 0 秒，1 盐酸一酒精中分化数秒。 1 2 、切片脱水( 7 0 、8 0 、9 0 、9 5 乙醇各2m i n ，1
12、0 0 乙醇I 、I I 各5m i n ) 、 二甲苯透明( 2 x 1 0r a i n ) ，中性树胶封片。 ( 二) 免疫组化结果评分标准 采用A l l r e ds c o r e 方法【5 ，6 1 ，具体如下：P S ( 百分比评分) 为阳性染色肿瘤细胞的 表达比例，( O ，不表达；1 ， 2 3 ) 。I S ( 强度评分) 为阳性染色肿瘤细胞平均的表达强度( O ，不表达；1 ，弱，2 ， 中；3 ，强) 。T S ( 表达评分) = P S + I S ，0 - 2 分为阴性， 3 分为阳性。 三、统计学处理 计数资料的阳性率比较采用卡方检验，计量资料( 如表达评分)
13、两组问比较 采用非参数M a n n W h i t n e yU 检验，两组之间相关分析采用S p e a r m a n 相关。P 2 0 m m 腺外侵犯 + 淋巴结转移 + T N M 分期 I I I I 5 0 2 5 2 5 3 3 1 7 2 2 2 8 4 7 0 2 1 1 73 0 5 1 2 1 0 7 6 1 1 1 6 1 2 0 二、E RQ E R1 31 和E R1 32 在P T C 与结甲组织中表达情况比较 E R a ，E R l 3 1 和E R B 2 在P T C 与结甲组织中的表达模式不同。E R l 3 1 在P T C 与 结甲组织中的亚细胞
14、定位有显著差异，而E R a 和E R f l 2 在两者间的亚细胞定位没 有显著差异( 表1 和图1 ) 。E R a ，而不是E R l 3 1 和E R l 3 2 ，在P T C 与结甲组织中 的表达阳性率有显著差异( 表2 ) 。与结甲组织相比，P T C 组织中E R a 和E R l 3 2 表 达水平均升高，而E R l 3 1 表达水平降低( 表2 ) 。 表l ，E R a 、E R l 3 1 和E R l 3 2 在生育期女性N T G 和P T C 组织中表达的亚细胞 定位 E R a E R p lE R p 2 刚性率总分3| ；l I 性率总分冈I 性率 总分 a ，总分的均数(
