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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果透明颤菌血红蛋白研究现状及其在中药中的应用展望 【关键词】 透明颤菌属 关键词透明颤菌属; 血红蛋白类; 基因; 转基因 Current research status of Vitreoscilla hemoglobin and the prospective application in traditional Chinese medicine KEY WORDS Vitreoscilla; hemoglobins; genes; transgenes 氧传
2、递直接或间接 影响 着需氧生物的初级代谢和次级代谢。在哺乳动物中，血红蛋白具有氧结合特性，过去曾认为这种氧结合蛋白只存在于哺乳动物中，近期发现，它几乎普遍存在于动物、植物和微生物中1。透明颤菌血红蛋白是由透明颤菌属中产生的一种可溶性血红蛋白，这种血红蛋白能在贫氧条件下被大量诱导合成，使透明颤菌在微氧条件下能够很好地生存。随着 研究 的深入，发现该基因的表达在转录水平上受氧浓度调控。因此在以溶氧为限制条件的生物反应器中，尤其是在大规模、高密度微生物发酵和动植物细胞培养解决供氧 问题 领域具有潜在的 应用 前景。 1VHb的结构及特性 透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，属于贝日阿托氏菌属，
3、在沼泽、腐烂植物等贫氧的环境中生长旺盛。VHb在透明颤菌中被发现，最初被认为是“细胞色素o(cytochrome o, Cyo)”蛋白，具有末端氧化酶的性质2。Cyo在不同的环境条件下可呈现三种不同的状态，即氧化态、还原态、氧合态，并可以相互转化；其中还原态是生理活性态，而氧合态则是富氧条件下的表现形式。它在577、544和420 nm处有最大吸收峰，若向溶液中鼓入CO气体，则可形成蛋白CO复合物，在566、535及41nm处呈现特征吸收峰3。但是随着1983年真正的Cyo的分离和确定4，实验表明该蛋白在光谱学和氧结合动力学性质上与氧合肌红、血红蛋白相似3,。1986年，Wakabayashi
4、等6结合蛋白质初级结构、光谱性质、氧结合动力学确定了该蛋白的结构，并将该蛋白正式命名为透明颤菌血红蛋白。 VHb为同型二聚体，带有两个相对分子量为1575的亚基，每个亚基含有146个氨基酸残基和两个b型血红素7。完整的VHb是可溶性的，但是脱去血红素辅基便不可溶。序列 分析 表明，VHb与其它真核生物蛋白氨基酸有明显的同源性，其中与黄羽扇豆血红蛋白的同源性最高，达到248。真核生物的血红蛋白形成8个螺旋区，而VHb每个亚基形成6个螺旋区。X射线晶体学表明VHb在近端和远端有独特的血红素端囊7，初步认为受E螺旋和F螺旋的干扰所致，通过氢键和TyrB10、GlnE7、ProE8及LysE11四个残
5、基形成此结构。大多数种类的血红蛋白都有一个末端的His(E7)残基，该His残基通常通过氢键与氧结合。而VHb端囊的E7位置为Gln残基。定点突变表明，GlnEHis突变对VHb立体结构影响很大，野生型VHb解离常数比GlnEHis突变型蛋白大很多，因此，VHb与被束缚的氧亲和力小，从而使氧的传递速度更快9, 10，这与晶体学研究结果一致。而在N端存在某些结构差异，少了螺旋，这段序列曾被认为可能是前导肽，影响VHb的分布，使活性VHb主要分布在细胞周质11。近期用 电子 显微镜对VHb在透明颤菌和大肠杆菌中分布的分析结果表明，VHb主要分布在细胞质中而不是细胞周质，作者还认为细胞周质中的VHb
6、可能是VHb过量表达而被挤出的结果12。 VHb基因的克隆、表达与调控 0世纪80年代中期以前，学者们一直认为，可溶性Cyo在细胞呼吸中作为一种终端氧化酶而起作用。1986年，Orii等5对VHb与O2及VHb与CO结合的动力学进行了讨论，指出VHb可能是作为O2载体和储存物而起作用的。1988年，Dikshit等13根据已报道的VHb氨基酸序列合成探针，与透明颤菌基因组DNA进行杂交，在透明颤菌血红蛋白基因可能位区，得到了含有vgb基因的的DNA片段，且此vgb基因携带内启动子而不受载体启动子的控制；同年，Khosla等14也用类似 方法 克隆了vgb基因，在vgb重组大肠杆菌中表达时，同样
7、得出了vgb基因是以自身启动子启动表达的结论。他们还测定了vgb基因的核苷酸序列，结果与Wakabayashi6报道的VHb氨基酸序列十分吻合。 将vgb基因转入大肠杆菌中表达，VHb的量与环境中的氧含量有关，vgb基因启动子在微氧条件下被诱导15。将vgb基因启动子与氯霉素乙酰转移酶和儿茶酚双加氧酶等报告基因融合并转入大肠杆菌中表达，发现在低氧条件下的报告基因产物比高氧条件下多57倍，说明vgb基因启动子的活性受氧浓度的调控。当去掉启动子的vgb基因和大肠杆菌tac启动子融合后，其表达不再受氧调控而异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)可以增加表达
8、。vgb基因在大肠杆菌和透明颤菌中表达条件相似，都随溶氧水平下降而表达水平升高10。光谱分析表明，重组大肠杆菌表达的VHb的存在状态与透明颤菌中表达的VHb的存在状态相一致：在富氧条件下呈氧合态，而缺氧条件下呈现生理活性的还原态16。溶氧并非直接作用于vgb基因启动子上，而是由铁氧还蛋白NADP还原酶能抑制vgb启动子的表达，具体机制 目前 仍不清楚。 3VHb的生理功能 目前，透明颤菌血红蛋白使细菌在低氧条件下能够很好生存的生理功能尚不完全清楚，各国 科学 家对vgb基因进行了细胞定位、表达调控以及该血红蛋白对能量代谢和呼吸链影响等多方面的研究。 Kallio等提出了两种假设：易化扩散假说和
9、氧化还原效应假说。易化扩散假说认为VHb与氧结合增加了氧在细胞周质空间的传递量。Khosla和Bailey发现大肠杆菌中表达的VHb有3545分布在周质空间。VHb蛋白N端功能域具有弱输送前导肽的功能，从而使VHb分布在细胞周质空间和细胞质内，支持了易化扩散假说。氧化还原效应假说认为氧合透明颤菌血红蛋白可能影响了细胞内一些关键的氧化还原敏感分子的活性，可能是呼吸链上的某个关键酶，该影响可引起能量代谢效率的提高14。 吴奕等19提出了另一种假说即末端电子受体假说，认为氧合态VHb作为末端电子受体参与大肠杆菌呼吸链末端氧化过程，他们还依据这一假说定量研究了VHb对大肠杆菌能量代谢的影响。研究表明，
10、VHb在微氧代谢状态时的表达大大提高了呼吸链末端电子受体量，促进电子传递过程转向能量代谢效率较高的Cyo途径，从而使细胞适应贫氧的生活环境。 VHb对生长的促进作用在有细胞色素o而无细胞色素d的突变体中比在有细胞色素d而无细胞色素o的突变体中更加显著。VHb增加了这两种末端氧化酶(尤其是细胞色素o)的含量并提高它们的活力20。低氧条件下，VHb的存在使更多的葡萄糖转向磷酸戊糖途径代谢，而向三羧酸循环的碳源减少，总的ATP产量加大，而底物水平磷酸化产生的ATP减少21。VHb还增加大肠杆菌吸收氧的速率，但细胞中的NAD(P)H含量减小。说明VHb提高了电子传递链的周转率22。 VHb在大肠杆菌中
11、的表达明显促进了微氧条件下细胞的生长状况和蛋白质合成的能力。Khosla等23分析了VHb表达前后菌体蛋白的组成，蛋白质的种类没有改变；从产生效应的时间来看VHb的功能是由其本身所引起，而不是细胞在基因水平的二次应答。 尽管VHb的作用机制还需要进一步研究，但用光谱分析方法发现VHb蛋白可与氧结合成稳定的氧合态，氧合态的形成是VHb发挥生理功能的必需条件。多数证据显示，以这种氧合态的形式介入细胞与氧的代谢途径，最终影响某些基因的表达。 4VHb在中药中的应用展望 当前，随着人们医疗保健意识的增强，中药产业显现出巨大的优势，但同时我们看到，传统中药材的生产也面临着一些挑战，由于长期盲目开采致使生
12、态环境遭到破坏，许多野生植物濒临灭绝，一些特殊生态环境下的植物引种困难，能够引种的栽培中药材因为各种因素影响，人工栽培药材品质下降等问题使中药材质量产量得不到保障。另外，天然药材中药用价值高的有效成分含量往往很低，不能够满足市场需求，采用化学合成的方法又会遇到工艺流程复杂、成本高、合成过程中伴随着副产品及造成环境污染等问题。随着生物技术广泛应用到中药栽培中，使这种局面得到了些许改善。利用植物细胞培养及毛状根培养技术具有人工栽培和野生采集所不具备的优点：占地少，周期短，不受地区和季节的限制，便于开展大规模的生产；无污染，无重金属积累，产物疏松，对于进行有用成分的生产和提取尤其便利。利用细胞培养生
13、产活性成分较为常用，20世纪70年代日本利用细胞培养生产人参皂苷，现已采用大容量发酵罐，产出的皂苷组分及药理活性与亲本植物基本相同，皂苷含量为亲本植株的3倍以上24。利用毛状根培养进行活性成分生产，增殖速度快，合成能力强，产物稳定转化后遗传性能较稳定，并利于进行高产株系选择，如用黄芪毛状根生产黄芪甲苷等25。据不完全统计，药用植物毛状根培养已在26个科100多种植物中获得成功。目前，植物细胞和毛状根大规模培养所采用的发酵罐多为微生物发酵所采用的平叶式生物反应系统或气升式生物反应器。但由于植物细胞本身所具有的一些特殊性，如细胞容易聚集、细胞分化、细胞的脆弱性、代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系
14、的复杂性，使得植物细胞大规模培养难以达到最佳效果。 植物细胞及毛状根大规模培养存在着的制约因素限制了植物细胞次生代谢物合成能力的提高，甚至某些时候合成能力丧失。可见选择理想的生物反应器对植物细胞和毛状根大量培养很重要，需要考虑主要影响因素，如氧传输、营养物质混合性能和剪切力强度。增强反应器的混合性能，如增加通气和转速可以促进物质在反应器内传输，但较强的剪切力会对植物细胞产生伤害。因此反应器的设计和改进应综合考虑这几方面的因素，力求反应器的混合性能良好的同时，使系统的剪切环境降低。但是机械方面的改进往往成本高且达不到理想的效果，而VHb蛋白使专性好氧菌透明颤菌在限氧条件下生存得很好，为中药材细胞
15、和毛状根培养解决供氧不足问题提供了一条新途径。 由于vgb基因调控机制在专性和兼性耗氧菌中十分保守，它在多种微生物中都获得了表达，如假单胞杆菌、链霉菌、霉菌、欧文氏菌等。VHb在大肠杆菌中应用最早，也比较成熟。将vgb基因克隆到含淀粉酶的基因工程大肠杆菌，VHb的表达提高细胞密度，使酶产量提高数倍26。1999年，Nilsson等27得到了淀粉酶更高的含vgb基因的菌株 。vgb基因不仅能在大肠杆菌中进行表达，在其他菌种中也有很好的表现。VHb在链霉菌中的表达可促进菌体生长28；VHb还能有效提高头孢菌素C在霉菌中的产量29。Patel等30在假单孢杆菌中的研究也证实了vgb基因的表达对蛋白产量起正向作用。文莹等31将vgb基因转入阿维链霉菌和肉桂地链霉菌中，提高了抗生素的产量。Bhave等32证实了VHb在酵母菌中的表达使细胞具有更高的生长率，加强了氧呼吸效率，并提高了呼吸效能。VHb在转基因动物中的报道相对较少，有实验证明vgb基因转入已表达人组织型纤溶酶原激活物基因的 中国 仓鼠卵巢细胞中，tPA的产量提高4010033。 1997年，Holmberg等34根据VHb在以上微生物及动物细胞中的表达均提高细胞生长、蛋白质合成以及代谢产物合成的结果，构建了含有vgb基因的表达载体，通过根癌农杆菌LBA4404介导将vg
