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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果蛋白电泳检测脑脊液免疫球蛋白IgG的临床意义探讨摘要 目的：探讨中枢神经系统疾病患者脑脊液出现免疫球蛋白IgG特异性寡克隆区带的临床意义。 方法 ：中枢神经系统疾病患者同时采集血清和脑脊液标本，经琼脂糖凝胶电泳将蛋白质分离后，转移至硝酸纤维薄膜上，然后再采用免疫固定技术，利用高度特异抗体标记的酶，在固相酶免疫反应中进行显色后使样本呈现寡克隆区带，并对此寡克隆区带的免疫球蛋白的性质予以定。 结果 ：56例中枢神经系统疾病患者，其血清和脑脊液标本经免疫固定电泳后出现
2、深染寡克隆区带或较弱的单克隆区带有16例，其中6例患者血清与脑脊液标本同时出现寡克隆区带；10例患者脑脊液标本中出现寡克隆区带而血清未出现。 结论：采用辣根过氧化物酶标记抗血清进行蛋白电泳检测脑脊液免疫球蛋白IgG，可提高检测灵敏度，脑脊液标本无需浓缩即可进行检测，特异性好，可用于检测由内源性合成的免疫球蛋白IgG，可 应用 于临床诊断及鉴别诊断中枢神经系统疾病。 关键词 蛋白电泳；脑脊液；免疫球蛋白IgG；寡克隆区带 1材料与方法 材料 对象56例中枢神经系统疾病患者同一天采集的脑脊液及血清标本。 试剂琼脂糖凝胶：含g/ml琼脂糖；Tris巴比吐缓冲液pH()样本稀释液：含小牛血清白蛋白的盐
3、溶液;抗血清：含抗IgGper(根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白)TTF3显色剂及其稀释液及浓度为30%过氧化氢。 仪器免疫比浊 分析 仪(BM100)，全自动电泳分析仪，样本浓缩干燥盒模板固定块l,0 l,0 l, 100 l,00 l及ml的移液器。 方法 实验前准备配制抗血清，用抗血清稀释液作111稀释(即100 l抗血清稀释液中加入10 l抗IgGPERR抗血清)，使用前配制。配制TTF3显色剂，每mlTTF3溶剂中加入50 l TTF3及l0%的过氧化氢。采用免疫比浊法测定脑脊液及血清标本中IgG浓度。 标本处理须将脑脊液及血清标本的IgG浓度稀释为10 mg/L。对于脑脊液标本：若A
4、等于脑脊液标本的IgG浓度，取10 l脑脊液标本加入(A-10) l的样本稀释液。对于血清标本：若B等于血清标本的IgG浓度，先将标本稀释20倍，再取l已稀释的血清加入(B/100-2) l的标本稀释液。 电泳过程 加样在加样梳的每个孔中加入1l标本，将加样梳放置min，采用一块凝胶可检测3对样本的组合。 样本浓缩握住加样梳的塑料保护框，以加样齿向上的方式放入样本储存盒中，在室温中静置1min，使样本在梳的齿尖聚集，并由蒸发得到浓缩，然后由样本梳进行点样。 电泳电泳在20 的恒温状态及20 W的持续电流下进行，累计达到80 Vh。 免疫固定电泳后，加入50 l稀释的抗血清随后进行孵育。去除抗血
5、清，并吸干，以再水合剂使凝胶水合，除去水合剂，吸干。 显色加入ml稀释的TTF3溶剂孵育1min，再水合2次，吸干凝胶及烘干。 结果 蛋白免疫固定电泳及显色后可出现4种情况：患者脑脊液及血清标本中都未出现寡克隆区带，显示患者中枢神经系统未出现相关的免疫性疾病；患者血清中出现寡克隆区带而脑脊液中不存在，表明血脑屏障没有受到损伤；患者脑脊液及血清标本出现了同样的条带，显示血脑屏障受到损伤；脑脊液中出现而血清中不存在的极强烈的条带、单克隆区带、额外的或很弱的单克隆区带，可以指示内源性合成的免疫球蛋白IgG，显示患者中枢神经系统出现了相关的免疫性疾病；后两种情况是反映中枢神经系统病变的重要标志，可以判
6、断为阳性结果。56例中枢神经系统疾病患者中，16例为阳性结果，其中6例患者血清及脑脊液标本同时出现寡克隆区带，包括朱网膜下腔出血1例、颅脑外伤1例、脑膜炎2例、颅内感染1例；另外10例阳性患者脑脊液中出现而血清中不存在的极强烈的条带、额外的或很弱的单克隆区带，包括神经性梅毒5例、多发性硬症3例、格林巴氏综合征1例、结核性脑膜炎1例。 讨论 据国外 研究 报道，脑脊液蛋白电泳出现寡克隆区带的阳性率：多发性硬症为95%以上、格林巴氏综合征为57%、脊髓炎为6%、其他中枢神经系统疾病为7%。现阶段临床上诊断中枢神经系统病变主要依靠影像学结合临床 分析 ，但对某些中枢神经系统脱髓鞘病变，如多发性硬症、
7、格林巴氏综合征，早期诊断非常困难，病变早期影像学及常规检查无法诊断，而患者脑脊液中免疫球蛋白IgG增加发生早，脑脊液蛋白电泳IgG形成典型寡克隆区带，是早期诊断重要的、不可少的依据。本免疫固定电泳是利用酶标记抗体技术进行蛋白电泳检测脑脊液免疫球IgG，是一项创新性技术其灵敏度高、特异性好，便于 应用 临床诊断。该 方法 可使检测灵敏度提高100倍1，脑脊液蛋白浓度仅需5mg/L，标本无需浓缩即可进行检测，该方法对检测由内源性合成的免疫球蛋白IgG较定量检测血清和脑脊液中蛋白质再 计算 其指数的方法更为灵敏和特异1。若出现寡克隆区带则提示脑脊液中存在有内源性合成的免疫球蛋白IgG，寡克隆区带结果
8、直观，可明确判断中枢神经系统内源性合成的免疫球蛋白IgG存在2。本试验结果显示56例中枢神经系统疾病患者中，16例患者阳性，如：5例神经性梅毒、3例多发性硬症、1例格林巴氏综合征、1例结核性脑膜炎患者脑脊液标本中出现寡克隆区带，而血清中未见，其中神经性梅毒、多发性硬症患者阳性率为100%。蛛网膜下腔出血和颅脑外伤患者血清和脑脊液中都出现寡克隆区带，这可能与血脑屏障受到损伤有关。此外，对其他一些中枢神经系统疾病，如帕金森氏综合征、脊髓炎、癫痫等也有一定的价值，由于本文收集病例尚不够多，有待今后进一步探讨。 参考 文献 ： 1Stmultanous Determination of Cerebrospinal Fluid Oligoclonal Bands and the“ProtEin Index” byAgarose Electrophoresis and DensitometryJ.CLINICAL CHEMISTRY，VOL，32，7578. 2朱明德，沈霞. 现代 临床生物化学M.上海：上海医科大学出版社，1996，4，183189. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
