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1、紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究摘 要CRM1是核运输受体importin beta超家族中的重要成员，主要负责一些生长调节蛋白以及肿瘤抑制蛋白包括p53、p21、 FOXO、 PI3K/AKT、 Wnt/-catenin、AP-1 、NF-kB 以及Nrf2等的核运输。Crm1的过表达与许多癌症比如前列腺癌、肝癌等的发生相关，因此引起人们很大的关注，多年来被认为是抗癌的重要靶点。Crm1的过表达会不但与癌症的发生有着重要的关系，还与一些慢性疾病如皮肤炎症的发生有关系。引起皮肤损伤的外界环境因子常见的主要是紫外线，紫外线主要来源于太阳光，紫外线分为UVA（320400nm）、UVB（28032
2、0nm）和UVC（280nm），其中UVA可达皮肤表皮及真皮，使皮肤老化松弛、色素沉淀及产生日光性角化症等；UVB可使皮肤红肿、脱皮，产生类似烧伤的症状，部分会被平流层的臭氧吸收；UVC危害最大，但会全部被臭氧吸收。近年来随着臭氧层被破坏，紫外线对人们的生活影响越来越大。紫外线引起的严重的皮肤损伤与ROS的产生有关，而Keap1-Nrf2-ARE信号通路在细胞防御过程中起着重要的作用，在近几年对Keap1-Nrf2-ARE细胞防御通路的研究主要集中在研究Nrf2的激活剂上，机制主要是与Keap1上的Cys151反应从而激活Nrf2，使得Nrf2进入原子核内诱导二相去毒酶等的表达，从而清除ROS
3、，但是Nrf2会在Crm1介导下被运出核，所以研究Crm1调节剂来调节Crm1对Nrf2的核输出是另一种有效的激活细胞抗氧化防御通路的途径。本实验用白色豚鼠作为实验动物先建立动物UV辐射损伤模型，再用抗氧化活性较强的维生素E和维生素C联合使用来验证所建立的动物UV辐射损伤模型，最后运用动物UV辐射损伤模型来研究一种筛选得到的一种天然分子咖啡酸苯乙酯（CAPE）即CRM1调节剂的皮肤光保护作用。关键词：CRM1；UVB辐射损伤；Keap1-Nrf2-ARE通路；CAPE；核转运AbstractCRM1 is an important member of the nuclear transport
4、 receptor superfamily importin beta, primarily responsible for the nuclear transport of some growth regulator proteins and tumor suppressor proteins including p53、p21、 FOXO、 PI3K/AKT、 Wnt/-catenin、AP-1 、NF-kB and Nrf2, et. It causes a great concern for the overexpression of CRM1 being associated wit
5、h the occurrence of many cancers such as prostate cancer and liver cancer, et. In these years it was considered to be an important target for anti-cancer. Overexpression of CRM1 not only has a significant relationship with the occurrence of cancer, but also has a relationship with a number of chroni
6、c diseases such as skin inflammation.The common external environmental factor that causes skin inflammation is ultraviolet. In our life the ultraviolet mainly comes from sunlight, and the ultraviolet is divided into UVA (320400nm), UVB (280320nm), UVC (280nm). UVA can reach the epidermis and dermis
7、of skin, making the skin aging, loosing, pigmentation and generate solar keratosis psychosis; UVB makes the skin redness, peeling and produce a symptoms similar as burning damage, but some of them will be absorbed by the ozone in the stratosphere; UVC is the most harmful one, but it will all be abso
8、rbed by the ozone. In recent years, with the destruction of the ozone layer, ultraviolet impact on our life more and more.Ultraviolet-induced skin damage is associated with the generation of ROS, and the Keap1-Nrf2-ARE signal pathway plays an important role in the process of cellular defense. In rec
9、ent years, studies on the Keap1-Nrf2-ARE cellular defense pathway mainly focus on the Nrf2 activator. Reaction with the cys151 on Keap1 to activate Nrf2 to get into the nucleus and induce the expression of many enzymes and factors is the mainly mechanism of Keap1-Nrf2-ARE pathway on cellular defense
10、. However, Nrf2 will be transported out of nuclear in the CRM1-mediated nuclear export pathway, therefore finding a CRM1 inhibitor to inhibit the nuclear export of Nrf2 is another effective way to activate the cellular antioxidant pathway.In this research I firstly use white guinea pigs to establish
11、 the ultraviolet radiation damage animal model, and secondly use vitamin C & vitamin E to verify the ultraviolet radiation damage model, and in the end I use the ultraviolet radiation damage model to test the photoprotection effect of a natural CRM1 inhibitor caffeic acid phenethyl ester (CAPE) whic
12、h is obtained by screening.Key words: CRM1; UVB radiation damage; Keap1-Nrf2-ARE pathway; CAPE; Nuclear transport第一部分：文献综述1. CRM1介导的核运输机制1.1 CRM1介导的核输出核膜为DNA复制、RNA转录及核小体的生产提供了一个隔离的细胞内环境，核膜双层膜是一种参与出了细胞凋亡和增殖以外的细胞周期调节的选择性物理屏障。RNA的核质运输、核小体、重要的转录调节剂、细胞周期抑制剂以及特异的药物靶标都通过核孔复合体1和转运受体分子紧密调节，这些调节物质被称为核质蛋白2（Fig
13、 1.1）3。核质蛋白通过识别包含在每个蛋白质内的信号序列与货物蛋白结合，这些信号使其输入到核仁46，然后输入到细胞核（核定位信号）7，并输出到细胞质（核出口信号）811。所有物质运输入或运输出细胞核都要嵌入核膜横向结构，即核孔复合体（NPC）。NPC由大约30个核孔蛋白组成，嵌入在核膜双层膜中，每个NPC运输物质的能力，这取决于具体的核质蛋白及其货物。小分子蛋白或盐可以自由通过NPC，而大于45-60kDa的蛋白质不能自由通过NPC，需要可溶性核质转运受体或核质蛋白的协助。其中大多数核质转运受体属于核质蛋白-家族，每一个核质蛋白-识别唯一的一组货物蛋白或RNA。这种识别是通过货物蛋白上的核定
14、位序列（NLS）和核出口序列（NES）实现的。Fig 1. CRM1介导核输出示意图目前有三种核质转运信号已被确定，包括被输入蛋白/识别的碱性氨基酸NLS序列12、包含更为复杂的PY-NLS的核质蛋白-213和识别疏水富亮氨酸输出信号的细胞核穿梭蛋白（CRM1）。CRM1结合并出口蛋白质和RNA，已被证明是唯一能够识别NES的转运受体14,15。CRM1所识别的NES信号序列是疏水氨基酸序列，包括异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸16。NES的共有序列为HX2-3HX2-3HXH，其中H代表一个疏水氨基酸，X代表一个任意氨基酸，下表数字表示潜在的重复数量16,17。此序列可存在于很多
15、复杂的蛋白结构，例如-螺旋的蛋白质。在细胞核中RanGTP表现有高浓度，人们认为RanGTP的浓度梯度为核出口提供所需的能量18。NPC中12%-20%的核孔蛋白是由苯丙氨酸/甘氨酸重复结构域（FG-重复）构成19，而CRM1和其他输入蛋白-家族的核质蛋白拥有HEAT结构域（亨廷顿，延伸因子3、蛋白质磷酸酶2A和酵母PI3激酶TOR1），可以吸引并与核孔蛋白的FG-重复域相互作用，随着RanGTP浓度梯度引发的自由扩散，促进复合物移动通过NPC中心通道的核孔蛋白基质2。出口复合物在细胞核中形成，这些复合物有三个部分组成：RanGTP、CRM1、出口基质或货物蛋白20。CRM1结合在RanGTP
16、或者货物蛋白的核出口信号序列上的能力很弱，但当后两者以协同方式共同结合在CRM1上时，亲和力提高了500-1000倍21,22。CRM1-RanGTP-货物基质复合物在细胞核中形成后便通过NPC出口到细胞质中。进入细胞质后，RanGTP被RanGTP酶水解为RanGDP，出口复合物分解为各独立元件，将基质或货物蛋白释放入细胞质中。CRM1通过NPC被回收进细胞核进行下一个循环。CRM1是一个无处不在的核输出受体蛋白，对于其结合的发生，货物基质必须含有富亮氨酸的核输出信号序列，由蛋白质磷酸化、去磷酸化或突变引起的货物蛋白的三维构象变化会使NES暴露并与CRM1结合2325，其他的蛋白质修饰，例如SUMO化、泛素化、乙酰化或蛋白质特有辅助因子结合也会通过暴露出口信号引发核出口16,26,27。所以我们可以通过设计抑制CRM1与NES结合的化合物来对一些与核输出有关的疾病进行研究与
