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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果浅析CCL20在胸腺CD4+CD25+T细胞发育过程中的作用及其意义 【摘要】 目的: 研究趋化因子CCL20对小鼠胸腺CD4+CD25+双阳性T细胞发育的影响, 为天然调节性T细胞调控的研究提供基础数据。方法: 采用龄胚鼠胸腺进行体外培养, 以流式细胞术检测不同时间点胸腺CD4+CD25+细胞的变化, 同时计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果: 体外胸腺培养的第16天胸腺细胞比例, 细胞数量趋势变化与胸腺体内发育的第、 15、 16、 17、 18、 19天CD
2、4+CD25+双阳性T细胞的比例, 细胞数量的趋势变化相似; 在胸腺体外培养的第16天, CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例分别为%、 %、.08%、 %、.06%、.04%, 占CD25+T细胞的比例分别为%、 %、 %、%、%、%, 这一发育趋势与体内结果具有一致性。在mg/L的CCL20干预下, 胸腺体外培养的第3、天CD4+CD25+胸腺细胞分别从、.96下降至、 。结论: 体外培养的CD4+CD25+双阳性胸腺细胞数量和比例变化与体内发育变化趋势一致, CCL20明显下调胸腺CD4+CD25+的表达, 这将为天然调节性T细胞的调控研究提供有效的参考依据。 【关键词】 胸腺
3、细胞 CD4+ CD25+ CCL20 体外胸腺器官培养 Sakaguchi等1研究发现, 给小鼠输入CD4+CD25+T细胞, 会下调免疫应答, 研究者们进一步在动物模型和临床病例证实该细胞参与自身免疫病的发生、 肿瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反应。随后的研究证实了该群细胞为CD4+CD25+foxp3+调节性T细胞, 小鼠体内输注经同种抗原活化的CD4+CD25+T细胞, 可引起特异性免疫耐受2, 不仅如此, 它在免疫系统发育、 自身免疫、 肿瘤逃逸等过程中均扮演重要的角色, 成为当前免疫学研究的热点。调节性T细胞分为天然调节性T细胞和诱导调节性T细胞, 其中天然调节性T细胞对机体具有举足
4、轻重作用。目前就其来源、 亚群、 特点、 转归及其在T细胞活化中的作用研究都有了长足的进展, 但对这群细胞在胸腺发育中的变化及调控因素尚不清楚。而CCL20是CC亚家族的趋化因子3, 该趋化因子的受体分布于未成熟的树突状细胞、 T细胞、 B细胞上4-6, 在固有免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用7。人们对CCL20的研究显示该趋化因子在胸腺中表达明显8, 其受体CCR6是调节性T细胞的标志之一9, 但其在胸腺中存在的意义以及其是否参与胸腺CD4+CD25+T细胞的发育尚不清楚, 因此本研究拟采用不同孕龄的胎鼠, 以体外胸腺器官培养技术在体外以CCL20对调节性T细胞进行干预实验, 对CD4+
5、CD25+T细胞的体内外发育状态进行比较研究, 以期为该群细胞发育和调控的深入研究提供了依据。 1 材料和方法 材料周龄左右成熟雌性和雄性BALB/c小鼠(H2d), 雌鼠120只, 雄鼠20只, 由复旦大学实验动物中心提供。不同日期的孕鼠由本实验室负责交配完成。细胞培养试剂RPMI1640、 L谷氨酰胺; 双抗; 小牛血清/NBS; 胎牛血清; FITC标记兔抗小鼠CD4单克隆抗体; PE标记山羊抗小鼠CD2mAb。显微外科镊、 剪; 0.m微孔滤膜; D6450Hanao CO2培养箱; FACSCalibur流式细胞仪。趋化因子CCL20。 方法 孕鼠交配与鉴定 按照我们已建立的孕龄测定
6、方法和体外培养系统, 取成熟雌性小鼠23只和雄性小鼠1只于前1 d晚900左右合笼, 次日晨800左右取出雌性小鼠, 以见到阴栓形成为确认怀孕日期, 并计算为0 d, 将其单独饲养并标记, 在时再次观察腹部确认怀孕, 解剖孕鼠, 摘取胚鼠胸腺小叶用于实验10。 胚鼠胸腺器官的培养 医用明胶海绵切成1 cm2左右的方块, 放入24孔板中, 加入1 mL RPMI1640培养液。灭菌滤膜充分湿润后覆盖在明胶海绵上, 吸弃培养液, 使24孔板中最终剩培养液。颈椎脱位处死孕鼠, 从孕鼠子宫中取出胚鼠, 置于加有PBS的100 mm的平皿中, 根据大小等特征再次判断其胚龄。剪开胚鼠胸腔, 取出胸腺小叶经
7、PBS充分清洗, 每孔加8个胸腺小叶, 每组均为双复孔进行培养。CCL20干预组在培养的第0、天加趋化因子CCL20。体内胸腺细胞发育过程的研究分别取不同孕龄的母鼠, 依照以上步骤取出胸腺小叶后, 制成单细胞悬液, 计数、 染色10。 流式细胞术检测 制备胚鼠胸腺单细胞悬液。毛玻片碾碎, PBS洗3次, 弃上清, 调整细胞数为109/L, 加入1 L FITC标记CD4和PE标记CD2mAb, 轻轻混匀, 避光, 静置30 min。PBS洗3次后, 用500 L PBS重悬, 流式细胞术检测。检测体外培养胸腺时, 将胸腺小叶从滤膜上取出, 依照以上方法制成悬液并染色, BDcaliber机型检
8、测, Cellquest软件分析10。 统计学处理 所得数据用软件处理。 2 结果 .1 体外及体内胸腺细胞总数的变化 系统反映存在于胸腺细胞中的CD4+CD25+双阳性细胞的体内外发育状况, 首先观察了整个胸腺细胞的数量变化。结果显示: 胚龄鼠的胸腺细胞为双阴性时期或者稍有阳性, 是进行胸腺细胞发育研究的最佳起始时间10。体内发育过程中, 胎鼠胸腺小叶随发育时间增加逐渐增大, 胸腺细胞总数随母鼠育龄的增加持续增多, 从第天的104/每叶胸腺增加至第15天时的104/每叶胸腺, 出生前每叶胸腺的细胞数量上升至106, 出生2h内检测发现每叶胸腺的细胞数进一步增至106。与体内胸腺细胞发育规律类
9、似, 体外培养显示: 在d时间内, 胸腺细胞表型由CD4-CD8-双阴性向CD4+CD8+双阳性细胞发育。体外培养时肉眼可见胸腺小叶比培养起始时有形态的增大, 细胞计数显示每个胸腺小叶细胞数量随培养时间的增加而增多。培养第1天时每个胸腺小叶的细胞数量比刚取出时略有下降, 从第0天的104下降为104, 第2天开始上升, 到第6天时每个胸腺小叶细胞数量增长到106。 图1 胚鼠胸腺细胞数目的体内外动态变化 .2 CD4+CD25+双阳性胸腺细胞的体内外发育 进一步研究CD4+CD25+双阳性胸腺细胞的体内外发育状况显示: 在体内情况下, 胚鼠的胸腺细胞中CD4+CD25+占全部胸腺细胞的比例为%
10、, 1d增至峰值%, 而后降低至1d的%。CD4+CD25+细胞数在为104/胸腺小叶, 1d增加至105/胸腺小叶, 而后增至1d的104/胸腺小叶。CD4+CD25+占CD4+细胞的比例在为%, 1d增至峰值%, 而后持续降低至1d的%。CD4+CD25+占CD25+细胞的在比例为%, 后随发育时间的增加而持续增至%。体外培养的胸腺细胞与体内胸腺细胞发育规律类似: 体外培养1 d时, 胸腺细胞中CD4+CD25+的比例体内为%, d增至峰值%, 而后降低至d的%。CD4+CD25+细胞数在1 d为104, d增加至104, 持续增至d的104。CD4+CD25+占CD25+细胞的在1 d比
11、例为%, 持续增加至%。仅CD4+CD25+占CD4+细胞的比例与体内不同, 在1 d为%, 而后持续降低至d的%。 图2 胚鼠胸腺细胞中CD4+CD25+细胞的体内外动态变化 A: CD4+CD25+胸腺细胞百分比; B: CD4+CD25+胸腺细胞数; C: CD4+CD25+/CD4+百分比; D: CD4+CD25+/CD25+百分比. .3 CCL20干预胸腺CD4+CD25+细胞的发育 由于CCL20表达于胸腺中, 为了研究CCL20是否对胸腺CD4+CD25+细胞的发育产生影响, 以一定浓度的CCL20与胸腺细胞共培养, 结果显示在不同培养时间点均有不同程度的影响, 在培养的第3
12、、天, CD4+CD25+胸腺细胞的比例明显降低, 进一步的实验表明CCL20浓度的增加, CD4+CD25+胸腺细胞在体外培养时其所占胸腺细胞的比例呈剂量依赖关系, 提示CCL20在胸腺CD4+CD25+细胞的发育过程中扮演着重要作用。 图3 CCL20抑制胸腺细胞的发育呈剂量依赖性 表1 CCL20干预胸腺CD4+CD25+细胞的发育,005,2(5):71-576. 11 Hirahara K, Liu L, Clark RA, et al. The majority of human peripheral blood CD4+CD25high Foxp3+ regulatory T c
13、ells bear functional skinhoming receptorsJ. J Immunol,006, 177(7):488-4494.12 杨 谨, 李 昂, 杨 谦, 等. 过氧化物酶体增殖剂PFOA对小鼠免疫系统的影响J. 细胞与分子免疫学杂志,006,2(2): 157-160.13 Yagi J, Uchida T, Kuroda K, et al. Influence of retinoic acid on the differentiation pathway of T cells in the thymusJ. Cellular Immunology, 1997, 181(2): 153-158.14 Buri C, Gutersohn A, Hauser C, et al. The chemokines CCL11, CCL20, CCL21 and CCL2are preferentially expressed in polarized human secondary lymphoid folliclesJ. J Pathol,004,04(2):08-216. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
