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1、分子生物学基本研究法（上） DNA、RNA及蛋白质操作技术,现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物
2、的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,重组DNA技术发展史上的重大事件 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；,三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。,5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶 能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Bo
3、yer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。,图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。,大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。,大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。,是第一个
4、真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。,2、ColE1质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总DNA的50%左右。,3、pBR322质粒载体 由三个不同来源的部分组成的： 第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）； 第二部分来源于pSC
5、101质粒的四环素抗性基因（tetr）； 第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。,AmpR,优点是具有较小的分子量，其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。 具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,4、pUC质粒载体（包括四个部分）： (i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）； (ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）； (iii)大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其
6、编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因； (iv)位于lacZ 基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ 基因的功能。,优点： 更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500700个拷贝。,可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重
7、组体转化子的鉴定。 具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。,5、 pGEM-3Z质粒 长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。,6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列
8、在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。,7、pBluescript噬菌粒载体 pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。,SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录； （+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。 f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1
9、（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。,(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动； (ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；,(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记； (iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体
10、的重组子。,LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的-肽， IPTG（异丙基- -D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，合成的-半乳糖苷酶-肽能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶相互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，能水解外源加入培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使生长于含X-gal培养基中的转化菌落呈蓝色。,重组DNA操作过程示意图,图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主
11、细胞中进行繁殖。,具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。,图5-3 重组DNA操作过程示意图,5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要
12、实验手段。,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。,生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的
13、大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501,图5-4 溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图,5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分
14、子的增殖 通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。,图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选,为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。,CaCl2法 将快速生长期大肠杆菌置于经
15、0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。 将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。 转化效率可达到51062107个转化子/g超螺旋质粒DNA。,电击法 电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。 将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为4
16、.55.5毫秒。 电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。,PCR技术的原理 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。,DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（链的延伸）三步。 经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子
