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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果对耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药分析摘要：铜绿假单胞菌是一种临床上常见的医院内的条件致病菌，本研究通过，了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制，以利于临床合理用药。现报道如下。1 资料与方法 资料(1)菌株：收集自200年1至12月本院仪检出的耐亚胺培南铜绿假单胞菌株。铜绿假单胞菌标准菌株ATCC7853一株；(2)药敏纸片：头孢塞肟、头孢曲松、头孢他定、亚胺培南；(3)OprD2基因扩增试剂盒：裂解液A、裂解液B、反应液、耐热酶、阳性模板；(4)其他：%，无菌生理
2、盐水，M-H平板，血平板等。 方法(1)纸片扩散法初筛：将新分离的纯菌种配成密涂于M-H琼脂平板10min后于平板中央贴上EDTA纸片，纸片分2组：1组为头孢塞肟、头孢曲松，在距离EDTA纸片1cm处对称分别贴上头孢塞肟和头孢曲松。另1组为头孢他定、亚胺培南，在距离EDTA纸片1cm处分别贴上头孢他定、亚胺培南。35培养24h后观察结果。结果判断：出现协同现象可能为产金属酶；不出现协同现象可能为膜通透障碍或既产金属酶又有膜通透障碍；(2)粗提酶将新分离的纯菌种配成,取50l于肉汤中35培养增菌24h后取1ml于离心管中，-80反复冻融数次，培养无菌生长后于4离心机，以10000转/min离心2
3、5min，取上清液后-80保存待用；(3)改良三维试验： 将铜绿假单胞菌标准株ATCC27853配成密涂于M-H平板待干后于平板中央贴上亚胺培南纸片，距纸片2mm处分别成180打2个宽1mm、长2cm的槽，在加酶粗提液20l、加酶粗提液+EDTA35培养24h后判断结果结果判断：有扩大生长、抑菌圈光滑完整则为产金属酶；有扩大生长、抑菌圈光滑完整则为产金属酶以外的碳青酶烯酶；、抑菌圈均光滑完整则为膜通透性障碍；(4)PCR：菌株处理：挑取少许新分离的纯菌种置入内含无菌生理盐水的离心管，离心15000rmp5min，弃上清液，加裂解液A0l，裂解液Bl，混匀后置入55保温1h后置入95保温5min
4、 ，离心10000rpm30 min，上清液即为扩增的模板液。反应体系配制：将反应液管内液体全部移入耐热酶管，以15l至20小管，实验时将5l膜板液移入反应体系中并加盖石蜡油2滴即可。热循环参数：95预变性2min然后9330min5530min7260min共循环35周期，最后一个周期72延长至2min。结果观察：取扩增产物10l与2l溴酚兰指示剂混匀，点样于2%琼脂糖凝胶中，以100v电压电泳2030min，出现与阳性膜板分子量相同的条带即为阳性。2 结果 表型初筛结果株铜绿假单胞菌中有株产生协同现象占44%。 改良三维试验结果株铜绿假单胞菌中有株产金属酶占22.%。结果株铜绿假单胞菌中有
5、株为OprD缺失，即由膜通透障碍引起占1.%。2株铜绿假单胞菌抗菌药物敏感性统计见表1。表12株铜绿假单胞菌的抗菌药物敏感性统计 讨论 亚胺培南是一种新型的-内酰胺类抗生素，属碳青酶烯类，具有较好的抗菌活性，且对-内酰胺酶稳定，是治疗假单胞菌感染活性最强的药物之一，但随着临床的广泛使用，耐亚胺培南菌株开始出现并日益增多，严重限制了亚胺培南的应用。铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药常不是由单一因素造成的，目前认为造成本菌耐亚胺培南的已知主要原因有4种，即(1)产生内酰胺酶：据Pai 等报道部分菌株可能产-类酰胺酶，本实验中由于产金属酶而耐药的菌株为5株(%)；(2)膜通透性障碍：即其外层细胞壁的外膜蛋白
6、D2是碳青霉烯类抗生素进入的通道，失去特异性外膜蛋白D2导致药物不能进入细菌体内，Statake等认为患者接受过其他内酰胺类药物抗感染治疗后，会诱导铜绿假单胞菌失去其膜蛋白通道oprD2，从而对亚胺培南形成耐药，本实验OprD2基因扩增结果显示：22株铜绿假单胞菌中有4株菌株表现为OprD2缺失(%)；(3)细胞外膜主动外排系统的表达；(4)青霉素结合蛋白的改变：本实验未涉及3、点，在此也作详叙述。以上可见碳青霉烯类抗生素耐药机制的复杂性。因此，在治疗铜绿假单胞菌引起的疾病时，建议在临床上选择抗菌药物时以细菌培养为前提，药敏实验结果为依据，合理选择敏感的药物治疗方案，防止耐药菌株的出现和传播。
7、 【参考文献】 1 陈东科，张志敏，张秀珍.三维法检测-内酰胺酶的影响因素探讨方法的改进.中华检验医学杂志，XX，26：600604. 朱琴，彭少华. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制.医学新杂志，XX，12：206207.Pai H , Kim J . Carbapenem resistance mechanis in pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob gents hemother ,XX,45:480484.Statake S, Yoneyama H ， Nakae T. Role of Omp Dand chromosomal lactamase in carbopenem resistance in clinical isolates of pseudomones aeruoginosa. J Antimicrob Chemother ,1991,28:199207.叶晓光，王若伦. 铜绿假单胞菌耐药性动态变化特征及分析. 中华医院感染学杂志，XX，14：607609.论文网在线 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
