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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果大豆异黄酮苷元检测方法的研究 作者：张磊,金桂芳,杨红,习志刚 【摘要】 目的 建立大豆异黄酮苷元含量测定 方法 。方法 采用HPLC法，Diamonsil C18柱 (250 mm,m)，流动相：甲醇-%磷酸溶液，流速/min，测定波长260 nm,柱温2。结果 制备的大豆异黄酮苷元总含量为%;大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率分别为%、%和%，RSD分别为%、%和%。结论 所建立的测定方法重现性好、可靠，可用于3种大豆异黄酮苷元的含量测定。 【关键词】
2、大豆异黄酮苷元；高效液相色谱法；含量测定 Abstract:Objective To establish an HPLC method for the content determination of isoflavone aglycones. Methods Isoflavone aglycones were analyzed on a Diamonsil C1column (250 mm，m). A mixture of %H3PO4，旋转蒸发器(上海亚荣仪器厂)，SH2-D循环水真空泵， 电子 天平。 染料木素、大豆苷元和黄豆黄素对照品 (购于上海同田生化技术有限公司,纯度均99%)，脱
3、脂豆粕，AB-8大孔树脂，聚酰胺；甲醇(色谱纯,英国TEDIA公司)，屈臣氏蒸馏水，其余试剂均为 分析 纯。 方法与结果 .1 大豆异黄酮苷元的制备 取豆粕适量，用8倍量体积分数为70的乙醇溶液浸泡30 min，80 水浴回流提取2次，每次90 min；合并提取液，过滤后回收乙醇、浓缩；上AB-8大孔树脂,以体积分数为50的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，45 烘干。适量乙醇溶液溶解，拌样上聚酰胺柱，以体积分数为70的乙醇溶液洗脱，得粗提浸膏，4烘干。取一定量的粗提物置于圆底烧瓶中，加入4倍量的7%盐酸-乙醇液，80 水浴水解h，浓缩，乙醚萃取，挥干乙醚；用适量体积分数为70的乙醇溶液溶解，石
4、油醚脱脂，用200300目硅胶拌匀， 自然 干燥，上硅胶柱，用三氯甲烷-甲醇洗脱，收集洗脱液，挥去溶剂，得大豆异黄酮苷元混合物3,4。 .2 样品溶液的制备 精密称取大豆异黄酮苷元混合物 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为 mg/mL的样品溶液。 .3 对照品溶液的制备 分别精密称定大豆苷元、染料木素对照品 mg、 mg各置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，得浓度为 mg/mL的大豆苷元及 mg/mL的染料木素对照品溶液；精密称定黄豆黄素，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取 mL，至mL容量瓶
5、中，加甲醇至刻度，摇匀，得 0 mg/mL的黄豆黄素对照品溶液。4 储存备用。 .4 色谱条件56 Diamonsil C18柱 (250 mm，m)；柱温2；流动相：甲醇-%磷酸溶液；流速=/min ；测定波长260 nm；进样量：20 L。 .5 线性关系 分别精密吸取上述大豆苷元、染料木素、黄豆黄素对照品溶液0.、置100 mL量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液。同法制备混合对照品溶液-，浓度见表1，混合对照品HPLC色谱图见图1。 表1 混合对照品溶液中大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的质量浓度 Contents of genistein,daidzein and glycitein in
6、 the control sample/ 按上述色谱条件依法测定，分别以大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的浓度(g/mL)对峰面积作回归 计算 ,得回归方程分别为： y=+，r=； y=+，r=； y=+，r=。 大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在g/ mL， g/mL, g/mL范围内，线性关系良好。 1.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素 图1 对照品HPLC色谱图 HPLC chromatogram of reference substance .6 精密度试验 取对照品溶液，重复进样6次，记录色谱图，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为%、 %和%。 .7 重
7、复性试验 取同一批次大豆异黄酮苷元混合物6份，按“”项下，制备样品溶液，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为%，%和%。 .8 稳定性试验 取同一样品溶液分别在0、2、4、6、8、1h于上述色谱条件下测定峰面积值， 计算 RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为%、% 和%。 .9 回收率试验 取大豆异黄酮苷元混合物6份，精密称定，分别准确加入3种对照品溶液各适量，余同“”项下操作。分别计算得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率，结果见表2、表3、表4,结果表明，3种苷元回收率均符合要求。 .10 大豆异黄酮苷元含量测定 精密吸取样品溶液，测
8、定3次，结果见表3,样品中种苷元总质量分数为%,样品HPLC图见图2。 表2 大豆苷元加样回收率实验结果 Recovery results of daidzEin 表3 黄豆黄素加样回收率实验结果 Recovery results of glycitEIn 表4 染料木素加样回收率实验结果 Recovery results of genistein 表5 样品含量测定结果 Results of sample determination 1.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素 图2 样品HPLC色谱图 HPLC chromatogram of the sample 讨 论 大豆中异黄酮存在的形式主要是
9、结合型的糖苷,其含量占大豆中异黄酮含量的95%以上,虽然游离的苷元含量不足5%,但它们表现出来的活性要比结合型的糖苷高得多。在用水解法制备大豆异黄酮苷元时，常用酶、碱和酸法水解。酶水解条件要求高、成本高，碱性条件水解得到异黄酮苷元不稳定，容易降解，本试验用酸水解，而常用强酸中,硫酸、硝酸有氧化性，可能破坏异黄酮苷元上的酚羟基，所以本试验选用盐酸。 本实验分别考察了不同体积比的甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸，乙腈-水作为流动相，结果显示甲醇-磷酸，且流速为/min时,可使大豆苷元、黄豆黄素和染料木素3种苷元达到基线分离，也可使大豆苷、染料木苷和上述3种苷元共5种成分达到基线分离；豆粕提取物中有油脂，
10、样品用石油醚脱脂后，测定干扰少，效果理想。 本文采用高效液相色谱法同时测定3种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮苷元产品的生产制备及推广 应用 提供了支持。 【 参考 文献 】 1 张逊，姚文，朱伟云.肠道大豆异黄酮降解菌 研究 进展J.世界华人消化杂志，XX，14：973-978. 2 虞丹.植物雌激素大豆异黄酮的药理作用研究概况J.海峡药学，XX，19：-12.3 井乐刚,张永忠. 大豆异黄酮的物理化学性质J. 中国 农学通报，XX，22:85-87.4 黄才欢,欧仕益.大孔树脂分离纯化大豆胚芽中异黄酮的研究J.中国食品学报，XX，6：335-337.5 常凤启.秦振顺，韩会新.保健食品中大豆异黄酮的测定 方法 研究J.中国卫生检验杂志，XX，14(4)：430-432.6 罗少洪，陈伟强，陈耕夫.大豆总异黄酮的提取及含量测定J.广东药学，XX，15：7-9. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
