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1、项目名称：我国特有产毒动物多肽毒素的基础与应用基础研究首席科学家：梁宋平 湖南师范大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：湖南省科技厅一、研究内容 本项目将紧紧围绕“我国特有产毒动物多肽毒素基础与应用基础研究”主题，针对动物多肽毒素与疾病相关膜通道及受体的相互作用机制这个关键科学问题，从动物多肽毒素的多样性与结构特征、膜通道及受体的选择性、多肽毒素与膜通道及受体相互作用、多肽毒素应用基础4个层面上，集中针对（1）动物多肽毒素的分子多样性与结构特征；（2）动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用；（3）动物多肽毒素与膜通道及受体的相互作用机制；（4）具有重要药用前景的动物多肽毒素的临
2、床应用基础4个主要研究内容开展深入研究。拟解决的关键科学问题：本项目基于我国特有动物多肽毒素资源和长期的研究工作积累，紧紧围绕多肽毒素最终服务于“人口与健康”的方向，瞄准国际学术前沿， 根据多肽毒素作用于细胞膜通道和受体的普遍性特征，提出本项目拟解决关键科学问题为：动物多肽毒素与疾病相关膜通道及受体的相互作用机制。围绕这一关键科学问题，着重解决3个突出问题：（1）我国特有产毒动物多肽毒素的结构与功能关系（2）动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用（3）动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用的分子机制研究内容：（1）我国特有产毒动物多肽毒素的分子多样性与结构特征研究在已有工作基础上继续构建我国陆生和
3、海洋主要有毒动物（蝎、蜘蛛、蛇、昆虫、芋螺、两栖类等）毒腺基因文库；利用快速基因分离和质谱联用鉴定方法，高效分离动物多肽毒素，调查和确定我国不同地区产毒动物的多肽毒素资源的差异性，完善代表性有毒物种的毒素组学；测定代表性多肽毒素新分子的空间结构，揭示我国特有动物多肽毒素的分子多样性、结构特征及进化规律；进一步充实我国代表性陆生和海洋有毒动物的多肽毒素实体库；建立和完善我国共享的动物多肽毒素信息学数据库，挖掘、保护和认识我国特有动物多肽毒素资源。最终建立我国特有产毒动物多肽毒素资源库和数据库。（2）动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用研究在已有膜通道及受体表达体系基础上，规模地测定动物多肽毒素
4、与不同膜通道及受体的选择性相互作用，建立动物多肽毒素的膜通道及受体功能数据库；筛选专一性作用于疾病相关膜通道及受体的动物多肽毒素，发现一批具有研发创新药物前景的先导动物多肽毒素。（3）动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用机制研究研究我国特有动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用的模式（抑制、阻断、激活）；解析多肽毒素与膜通道相互作用的结构基础；开展多肽毒素与膜通道及受体复合物的相互识别与作用模拟，挖掘多肽毒素与膜通道及受体相互作用的结构信息学；发现和鉴定动物多肽毒素的新膜蛋白靶点及相互作用分子机制；揭示动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用偶联的相关信号通路和生物学效应；优化设计选择性毒素新分子，鉴定新
5、分子对相应膜通道及受体识别能力，为多肽毒素创新药物研发提供科学依据。（4）重要药用前景多肽毒素的临床应用基础研究针对于已鉴定和新发现具有药用前景的动物多肽毒素揭示药理学作用新机制；在阐明其与靶通道及受体相互作用的分子机制的基础上，设计多肽毒素类似物或模拟物；针对神经系统、心血管系统、肿瘤等重大疾病，利用目标疾病相关的药理学模型，开展先导多肽毒素和新设计类似物或模拟物的主要药效学，药动学和药剂学等临床前研究。二、预期目标本项目的总体目标：在动物多肽毒素的多样性与结构特征、多肽毒素对膜通道及受体的选择性、多肽毒素与膜通道及受体相互作用、多肽毒素应用基础4个层面，围绕“我国特有产毒动物多肽毒素基础及
6、应用基础研究”主题，全面实施以下4个方面研究工作：（1）我国特有产毒动物多肽毒素分子的多样性与结构特征（包括资源库和数据库的构建）；（2）动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用；（3）动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用机制；（4）具有重要药用前景多肽毒素的临床应用基础研究。建立我国重要产毒动物多肽毒素的资源库和数据库；发现选择性作用于肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等相关的膜通道及受体的动物多肽毒素，阐明其结构与功能关系，揭示其与膜通道及受体相互作用的分子机制；形成我国特色的在后基因组时代以动物多肽毒素功能为基础、以解析重大疾病发病机理，发现新药物作用靶点和创制多肽毒素药物为导向的创新药物研发的
7、网络体系和平台，促进我国生物医学基础研究和生物医药产业的发展。五年预期目标: 1、动物多肽毒素分子多样性和结构特征研究构建约30种我国重要产毒动物的毒素基因文库和多肽毒素组学库（成果以不同有毒动物的毒素基因文库存放于中国典型培养物保藏中心为标志，同时注册毒素的知识产权）；发现一大批新的动物多肽毒素，完善我国代表性陆生/海洋及两栖类有毒动物的多肽毒素实体库；解析10-15个具有重要功能的代表性多肽毒素新分子的空间结构；建立共享的动物毒素资源和信息学平台。2、动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用研究测定500个以上动物多肽毒素与不同膜通道及受体的选择性作用，建立动物多肽毒素的膜通道及受体药理学功
8、能数据库；鉴定20-30个选择性作用于疾病相关膜通道及受体的动物多肽毒素新分子。3、多肽毒素与膜通道及受体的相互作用机制研究研究疾病相关膜通道及受体（蝎毒素Martentoxin/钾通道BKCa、蝎毒素BmkAS/钠通道Nav1.8、蜘蛛毒素JZTXV/钠通道Nav1.8、蜘蛛毒素Huwentoxin-VI/膜通道TRPV1等）的结构-功能关系及其在生理/病理中的作用。在蛋白质一级结构和空间结构以及蛋白质复合物结构水平，采用结构模拟、多肽毒素和通道突变体构建、活性分析等方法，分析8-10个多肽毒素与膜通道及受体相互作用的结构基础，揭示动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用机制及多样性；发现2-4个
9、动物多肽毒素作用的新膜蛋白靶点，阐明其偶联的相关信号转导通路及其在生理/病理中的作用。4、重要药用前景多肽毒素应用基础研究确定58个作用于肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等重大疾病相关膜通道及受体的具有重要药用前景的先导多肽毒素；完成1-2个具有自主知识产权和药用前景的多肽毒素以及类似物或模拟物的主要药效学等临床前研究。5、优秀人才培养国家教育部“奖励计划”岗位或讲座教授1-2名，中科院“百人计划”入选人才2-3名，国家杰出青年科学基金获得者1-2名。培养博士后20-30名，培养博士生80-100名，硕士生120-150名。6、论文与专利发表SCI期刊论文100篇以上，其中影响因子5.0以上论文
10、20篇以上，获得国家发明专利授权10-15项，力争取得1-2个国家新药临床试验批件。三、研究方案整体研究思路：本项目在动物多肽毒素的多样性与结构特征、膜通道及受体的选择性、多肽毒素-膜通道及受体相互作用、多肽毒素应用基础4个紧密相关又层层推进的工作层面上，全面对（1）动物多肽毒素的分子多样性与结构特征；（2）动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用；（3）动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用机制；（4）重要药用前景动物多肽毒素的临床应用基础研究4个方面内容开展深入研究，针对关键科学问题，重点解决3个突出问题（1）我国特有产毒动物多肽毒素的结构与功能关系，（2）动物多肽毒素与膜通道及受体的选择性作用
11、，（3）动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用的分子机制。本项目整合了国内相关实验室已建立良好的生物信息学技术、结构测定、电生理技术、细胞生物学、药理药效和药剂学、动物行为学和模式动物模型等平台，围绕项目主题目标，强调交叉，通力合作，进行攻关。本项目的立意、总体研究思路、方案设计具有前沿性、创新性和实施的可行性（见图1所示思路）。 图-1 项目及课题的总体研究方案技术路线：本项目紧紧围绕关键科学问题“动物多肽毒素与疾病相关膜通道及受体相互作用机制”，针对于上述四个方面的研究内容，制定相关技术路线如图2、3、4、5、6所示。 图 2 我国特有产毒动物多肽毒素资源库和数据库构建的研究方案和技术路线 图
12、 3 动物多肽毒素与膜通道及受体选择性作用的研究方案和技术路线 图 4 动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用分子机制的研究方案和技术路线 图 5 动物多肽毒素新靶点鉴定及其信号通路的研究方案和技术路线 图6 先导多肽毒素的设计改造及临床应用基础研究的方案及技术路线可行性分析： 本项目有近40年的研究积累，已建立了完成项目目标所需主要技术平台，在“分子-细胞-组织-动物模型”不同层面上集积了国内相关领域中具有较好研究积累和特色实力的科研人员，通过学科交叉、平台共享、优势互补、刚性约束、通力攻关，在如下4个研究领域取得系列重大突破是完全可行的。1、我国动物多肽毒素资源库的构建与保护及资源挖掘研究本项
13、目相关课题组在毒素基因文库构建及基因分离方面处于国际领先水平，在多肽毒素的分离纯化方面的研究水平与国际相当。通过构建野生有毒动物多肽毒素基因文库，规模地分离和鉴定多肽毒素基因，不仅可以有效地保护我国野生有毒物种多肽毒素资源，而且还可以有效地挖掘和利用多肽毒素。2、我国动物多肽毒素与膜通道相互作用机制研究本项目相关课题组已具有规模地生产基因重组多肽毒素的能力，配置了多通道膜片钳系统，在进一步完善我国相关膜通道表达体系的基础上，可以规模地筛选和鉴定选择性作用膜通道和受体的天然动物多肽毒素。通过本项目课题组已成熟建立的氨基酸残基定点突变技术、蛋白质结构测定技术、国际领先的多肽毒素-膜通道相互作用的计
14、算机模拟技术等，完全可以揭示多肽毒素-膜通道及受体相互作用的分子机制及多样性。3、动物多肽毒素作用的新靶点和新通路研究本项目相关课题组前期工作中已开展了多肽毒素作用的新靶点和新通路的研究，比如脊椎动物非晶状体bg-crystallins在心脏、肺、胃肠道等组织广泛分布，虽然遗传学的证据提示这类基因和其蛋白产物与上皮组织的分化，发育和肿瘤抑制相关，但其功能和作用机制远未阐明。三叶型多肽与上皮修复与重建、炎症和肿瘤发生与迁移密切相关，但目前介导其生物学活性机制尚未揭示。昆明动物所项目组利用两栖类三叶型多肽毒素从血小板成功筛选到介导其生物活性的新型膜蛋白PHB；同时，初步发现三叶型多肽毒素与bg-c
15、rystallins复合物的细胞调节活性（pM浓度下诱导细胞迁移、nM浓度下引起细胞脱落、凋亡）和可能的囊泡化入胞，核定位及转录调节的细胞作用机制。在此基础上，充分利用外源“多肽毒素”取材方便，活性高，专一性强的优势，为解析非晶状体bg-crystallins和三叶型多肽的生物学功能和分子作用机制，揭示其与PHB家族蛋白的作用关系,以及它们所整合的细胞调节通路在上皮修复与重建、炎症和肿瘤发生与转移中的分子机制和作用位置提供全新的线索。4、具有药用前景的动物多肽毒素的应用基础研究本项目相关课题组前期工作中已开展了具有药用前景多肽毒素的临床应用基础研究，如军事医学科学院和湖南师范大学课题组开展了N-型钙通道抑制毒素的镇痛药用临床前研究，本团队的上海交通大学医学院课题组具备开展神经精神性疾病, 肿瘤等重大疾病开展药效学/药动学/药剂学研究基础和技术平台，已建立高血压、糖尿病、神经胶质肿瘤、疼痛、药物成瘾、癫痫等重要疾病的动物模型。在具有重要药用前景多肽毒素的结构与功能研究基础上，借助本项目相关课题组的药物筛选、功能鉴定及药物设计技术平台，动物模型评价技术平台，有望发现鉴定5-8个作用于上述疾病相关膜通道及受体的高度特异性多肽毒素，并创制2-3个疾病相关膜通道及受体的具有成药性的多肽毒素类似物或模拟物。
