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1、项目名称：重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致病机制研究首席科学家：陈创夫 石河子大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：新疆生产建设兵团科委 教育部一、研究内容研究内容1布鲁氏菌病、斑点热和无形体病分子流行病学和流行规律研究 三种病原中国流行株病原特征及分子流行病学研究：通过在重点疫源地进行全面系统的流行病学调查，建立我国三种病原菌种资源库，分析我国三种病原流行株的种型特点以及优势株演替和遗传变异规律，确定危险媒介和宿主动物及其在疾病传播中的作用。 2布鲁氏菌、斑点热立克次体、无形体侵染和胞内寄生机制的研究 (1) 三种病原基因组学和蛋白组学研究：通过基因组学、蛋白组学、转
2、座子突变等功能基因组学技术研究布鲁氏菌标准菌株、疫苗株和我国流行株（牛种、羊种、绵羊种布鲁氏菌019株），筛选影响布鲁氏菌毒力和致病性的主要基因及相关外膜蛋白，鉴定其生物学功能；研究布鲁氏菌在宿主细胞内、外生长时菌体基因及蛋白表达谱的变化，并揭示差异表达蛋白的生物学功能；通过对我国斑点热立克次体代表株与国外斑点热立克次体比较基因组学和蛋白组学研究，发现我国斑点热立克次体的主要毒力基因及相关蛋白，明确其生物学功能；通过对我国无形体流行株的基因组学研究，分析我国无形体流行株的遗传学特征，明确其与世界各地流行株的差异。 (2) 布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞及其胞内寄生机制研究：通过酵母双杂交、免疫
3、共沉淀、噬菌体展示、siRNA等技术筛选布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞过程中的宿主因子和相关蛋白，确定其生物学功能；研究布鲁氏菌的调控基因及效应分子干扰布氏小体与溶酶体融合以及抑制宿主细胞凋亡的分子作用机制； (3) 斑点热立克次体与血管内皮细胞相互作用机制研究：通过蛋白双向电泳、基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱分析等发现斑点热立克次体与血管内皮细胞之间发生特异性相互作用的分子，明确其毒力相关分子在致病中所起的作用。 (4) 无形体侵染粒细胞分子机制研究：通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术筛选无形体与粒细胞之间发生特异性相互作用的关键分子，确定其在病原体侵染宿主细胞过程中的作用。 3布鲁氏菌
4、、斑点热立克次体免疫的分子机制研究 (1) 布鲁氏菌主要保护性抗原及其表位研究：利用体外抗原诱导表达、ELISPOT和Tetramer等研究技术，筛选布鲁氏菌主要保护性抗原及其T、B细胞抗原表位。 (2) 布鲁氏菌主要保护性抗原表位与宿主MHC分子相互作用研究：利用基因芯片和蛋白芯片技术筛选与布鲁氏菌主要保护性抗原蛋白递呈相关的宿主MHC分子种类，研究其结构特征和表达的时空变化，揭示宿主MHC对布鲁氏菌主要保护性抗原的限制、表达、处理和提呈的影响。 (3) 布鲁氏菌免疫逃避的分子机制研究：通过FACS、ELISA、ELISPOT、免疫细胞和/或分子缺陷动物验证技术等，研究Breg、Treg在布
5、鲁氏菌感染免疫过程中作用的分子机制，阐明布鲁氏菌感染免疫应答及免疫逃避的分子机制。 (4) 斑点热立克次体免疫的分子机制研究：通过对我国斑点热立克次体与免疫应答启动细胞树突状细胞之间，激活树突状细胞与T淋巴细胞之间的的相互作用研究，发现斑点热立克次体与宿主免疫细胞之间相互作用的分子，揭示斑点热立克次体诱导免疫应答的分子机制。二、预期目标（一）总体目标 掌握我国布鲁氏菌病、斑点热和无形体病的流行特征和规律，阐明三种病原致病的分子机制，取得一批在国际上具有重要影响的研究成果，提高我国在三种传染病防控基础研究领域的国际地位，为国家在疫病防控和公共卫生安全等方面提供科学技术储备及咨询服务。培养一批在人
6、兽共患胞内寄生菌病研究领域的专业拔尖人才。 （二）五年预期目标 1深入认识我国布鲁氏菌病、斑点热和无形体病的流行特征和规律，完成我国三种传染病的分子流行病学调查报告，为疫病防控提供科学决策依据。 2. 建立我国三种病原的菌种资源库和三种传染病的流行病学数据库；建立三种病原流行株遗传信息库。 3. 发现三种病原中国流行株新的毒力基因并阐明其生物学功能，揭示三种病原侵染、胞内寄生、致病和免疫的分子机制，为研发新型疫苗、诊断试剂和筛选药物作用候选靶位基因奠定坚实的理论基础。 4. 培育具有我国优势特色的三种传染病创新研究团队23个，培养在国内外相关研究领域有一定影响力的学术带头人35名，培养博士研究
7、生25名和硕士研究生60名。 5. 完成高水平SCI收录研究论文60篇以上。三、研究方案（一） 学术思路 围绕严重危害人民生命健康和畜牧业经济发展重要人兽共患传染病的防控，保障公共卫生及生物安全这一国家重大需求，重点解决疫病流行规律和病原致病分子机制两个关键科学问题。从病原特征及分子流行病学、病原生态学两个方面研究三种传染病的流行规律；从病原基因组与蛋白组、胞内寄生机制、免疫分子机制三个方面研究三种病原的致病分子机制（图1），为开展疫病防控、新型药物、诊断试剂和疫苗研发奠定坚实科学基础。 图1 项目学术思路（二） 技术途径 本项目拟通过以下技术途径来实现预定的目标，具体如图2：图2 项目技术路
8、线（三） 创新性 1通过对我国各个地区全面系统的流行病学调查，首次提供三种传染病在全国范围内的流行病学本底资料，建立三种胞内寄生菌的菌种资源库，构建三种传染病流行病学数据库。 2对致病性发生改变的中国流行株进行基因组测序与注释、比较基因组学和蛋白表达谱分析研究，揭示其特有的分子特征、新的毒力基因和遗传变异规律，建立三种病原流行株的遗传变异信息库。 3. 从分子、细胞、机体水平研究三种病原中国流行株与宿主相互作用关系，全面、系统、深入地揭示中国流行株侵染、胞内寄生及免疫逃逸的分子机制。 （四） 与国外同类研究相比的特色 1三种传染病在我国的分布范围广，危害严重。我国的生态环境复杂多样，自然疫源地
9、生态环境和地理景观因素差异很大，有十分丰富的资源。采用流行病学与生态学相结合、现场与实验室相配合、病原学和分子生物学技术相补充的方法，研究生态环境多样性与疫病发生发展之间的相互关系，为三种传染病流行病学数据库的建立提供了丰富的数据资源。 2. 布鲁氏菌在我国长期流行，自1953以来积累了来源于我国不同地域、不同年份的布鲁氏菌株2400多株，菌种资源丰富，这为分析布鲁氏菌的遗传多样性、分子流行病学规律提供了有利的研究条件。 3本课题组分离的布鲁氏菌绵羊种019株，生物学特征独特，能感染恒河猴，提示该分离株对人有潜在的感染性，这与国际公认绵羊种布鲁氏菌不感染人的特性明显不同。序列分析发现，019株
10、Omp25、Omp2a、omp2b、omp31、virB10等基因与国际标准株63/290相应基因相比存在明显的差异。弄清这种差异的生物学意义将有利于阐明布鲁氏菌绵羊种019株跨宿主感染的分子机制。 4黑龙江立克次体为我国1983年从黑龙江绥芬河分离的一个斑点热立克次体新种，为远东斑点热的病原体，其致病性与西伯利亚立克次体标准株存在差异。因此，对黑龙江立克次体流行株的基因组和蛋白质组进行研究，发现其独特的分子特征，为进一步揭示其致病性改变的机制奠定基础。 5. 2006年我国首次报告确诊的人粒细胞无形体感染病例，其中1人感染者死亡，而且首次发现人粒细胞无形体病可以在人与人之间相互传播。这说明中
11、国无形体流行株临床表现为重病型，而且其传播途径也发生了改变，这可能与病原体毒力变异有关。因此，在国内建立无形体培养方法，分离我国不同地区人及动物宿主无形体本土分离株，填补我国分离株菌种资源的空白；研究分析我国无形体病原分离株分子遗传学特征，阐明我国无形体病的致病机理具有重要意义。 6. 本项目组在国际上首先构建了绵羊基因组MHC区段高密度物理图谱并对该区段近250万碱基进行了基因测序和注释，该研究成果将有利于揭示布鲁氏菌感染绵羊前后MHC表达谱的变化与病原特异性抗原递呈的关系。 （五）取得重大突破的可行性分析 1具有丰富的资源优势 迄今为止，已分离鉴定了来源于全国不同地域、不同年份的布鲁氏菌菌
12、株共计2400多株，病原所处的生态环境比较清楚；另外，我国目前正处于经济建设全面发展阶段，自然资源的大量开发和生态环境建设，势必会对当地的自然生态环境和景观产生影响，形成了次生和原始生态系统并存的格局，为开展相关研究提供了多样、可比的研究现场。因此，我们的研究与国际同行相比，具有明显的资源优势。 2良好的前期研究基础 项目组成员在布鲁氏菌病、斑点热和无形体病的流行病学、致病机制方面做了大量的研究工作，已在JAMA、Emerging Infectious Disease、PLoS ONE、Journal of Clinical Microbiology、American Journal of T
13、ropical Medicine and Hygien、BMC Infectious Diseases、BMC Microbiology、Journal of Medical Virology等权威期刊上发表了一系列的论文。 3成熟的技术平台 项目参加单位拥有传染病预防控制国家重点实验室、病原微生物和公共卫生安全国家重点实验室、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业生物技术国家重点实验室、农业微生物学国家重点实验室、新疆地方与民族高发病教育部重点实验室、上海国家动物医学研究中心，构成了完善的流行病学调查和感染与免疫研究平台，包括微生物基因组学研究平台、功能基因组研究平台、功能蛋白组学研究平台、
14、生物信息学和数据库的研发平台以及生物芯片研发平台。 4具有优势互补的研究队伍 参加本项目的人员主要来自石河子大学、军事医学科学院微生物流行病研究所、中国疾病预防控制中心传染病控制所、中国农业大学、南方医科大学、华中农业大学、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院上海兽医研究所8个科研院所。学术带头人和学术骨干来自医学、兽医学的相关研究领域，在人兽共患病流行病学、病原微生物学、基因组学、免疫学等领域，优势互补，研究实力雄厚。四、年度计划2010年1月至2010年12月(1) 选择代表性样区，进行现场调查和动物宿主和媒介标本的采集，对其进行多种病原体的检测，并进一步进行分型鉴定和变异分析。完
15、成本年度三个代表性样区的调查和标本检测；完善病原体变异分析。(2) 标准菌株转座子突变文库构建和突变株毒力表型筛选及鉴定；标准株衍生具有致病表型菌株转座子突变文库构建和致病性表型筛选；羊布鲁氏菌外膜相关蛋白原核表达载体构建及诱导表达；羊布鲁氏菌标准株流行株间差异表达的鉴定；人工培养条件下牛布鲁氏菌标准株及其衍生的VirB基因缺失株间差异表达蛋白的鉴定。完成羊种布鲁氏菌转座子突变文库毒力表型筛选插入位点序列测定和实验动物体内的毒力测定；完成羊种布鲁氏菌标准株衍生具有致病性表型菌株的转座子突变文库致病性表型筛选和插入位点序列测定；完成羊布鲁氏菌外膜相关蛋白原核表达载体构建及诱导表达鉴定；利用绵羊布鲁氏菌标准株流行株初步鉴定二者间差异表达蛋白；完成人工培养条件下牛布鲁氏菌标准株及其衍生的VirB基因缺失株间差异表达蛋白的鉴定。(3) 布鲁氏菌侵染过程中细菌外膜蛋白和侵染细胞膜蛋白相互作用的筛选研究：采用同位素掺入方法，对布鲁氏菌蛋白进行标记，提取带有标记的布鲁氏菌外膜蛋白，采用布鲁氏菌侵染巨噬细胞、上皮细胞，提取细胞膜蛋白，进行双向电泳，转膜后与同位素标记的布鲁氏菌外膜蛋白进行杂交试验，对相互作用的蛋白进行质谱分析；布鲁氏菌在胞内转运过程中细胞特异表达蛋白的筛选研究
