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1、项目名称：内源性代谢产物硫化氢与介导心脏生理与病理机制的蛋白质靶分子的相互作用及其机制首席科学家：朱依谆 复旦大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 上海市科委一、研究内容综合应用代谢组学、基因组学、蛋白质组学、结构生物学等方法和技术，以重要的心血管生理和病理调控通路为研究主要对象，研究硫化氢与蛋白质靶分子的相互作用及其机制；研究硫化氢对蛋白之间、蛋白质和核酸之间相互作用的调节及其机制。阐明心脏中内源性硫化氢在生理和病理情况下的生成代谢途径，探讨硫化氢的分解代谢过程。1. 揭示若干H2S调控跨膜离子转运的重要通路；发现若干H2S直接作用的靶分子；明确H2S与靶分子蛋白相互
2、作用的分子机制。2. 分离和验证H2S细胞效应相关的细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路中的重要蛋白因子，结合基因组学，蛋白质组学, 生物化学和分子生物学以及细胞生物学的实验结果揭示H2S细胞效应的分子机制和重要蛋白的作用机理和生物学功能。3. 应用独创的半胱氨酸衍生物SPRC可作为分子探针，全面揭示含硫氨基酸体内代谢的基本规律。筛选出与含硫氨基酸及探针药物SPRC的心肌缺血保护作用密切相关蛋白分子，并对其功能进行研究，探寻含硫氨基酸及探针药物生物学效应和代谢通路的机体内源性拮抗剂和抑制剂，可能是具有临床应用前景的防治心血管疾病的新策略。4. 阐明心脏中CSE途径和ATT/MST途径的表达调
3、控机制及两条途径的协调机制。阐明CSE在生理条件和病理条件下表达调控的实时监测和在体研究，同时对阐明CSE的调控网络也非常重要。阐明H2S跨膜传递及与氧化性小分子和金属离子的反应特性。H2S的跨膜传递关系到内源性H2S的作用方式以及外源性H2S或H2S供体作为药物的可行性；与氧化性小分子和与金属离子的反应特性则与H2S的分解代谢相关。二、预期目标（一）总体目标采用蛋白组学和代谢组学的经典研究方法，结合心血管疾病的生理和病理过程，从细胞水平到整体水平进行动态研究。以缺血性心脏病为核心，探讨体内活性代谢产物小分子气体信号-H2S对心血管系统保护作用的分子机制，筛选分离出特异的靶蛋白、目标基因和生物
4、标记物；进一步利用结构生物学，生物化学的方法研究蛋白之间，蛋白和DNA，RNA的相互作用机理。全面阐述心脏中内源性H2S在生理和病理情况下的生成代谢途径，以及生成的内源性H2S在细胞内和细胞间的传递过程以及传递过程中与氧化性小分子（如NO，H2O2）及金属离子的相互作用，从而探讨H2S的分解代谢过程。（二）五年预期目标1. 阐明H2S在细胞水平上的传递过程，探讨H2S传递机制及传递过程中参与的反应，如H2S对氧化应激蛋白和凋亡相关蛋白的构象和正常功能的影响。该工作可能找到体内H2S新的作用靶分子，从而为最终阐明H2S对心脏保护作用的机制提供理论依据；2. 阐明H2S传递机制及传递过程中蛋白之间
5、，蛋白和DNA，RNA的相互作用机理，为在哺乳动物中揭示H2S细胞效应的分子机制和阐明H2S在生理病理上的作用提供理论依据；3. 细胞水平和整体水平上研究内源性H2S产生相关酶CSE在应激条件下（如氧化压力）和病理状态下表达调控的机理，找到相关转录因子及激活这些转录因子的信号通路和相关蛋白分子，为设计激活体内内源性H2S产生的药物打下基础；4. 培养一批国际一流心脏蛋白组学领域科研人员，培养一批高水平的中青年科学家，提高我国蛋白组学科研水平和自主创新能力，增强国际竞争力。5. 研究成果将以论文形式表现，发表高水平论文2030篇（其中510篇IF10），申请1015项发明专利。三、研究方案（一）
6、课题总体思路鉴于目前蛋白质组研究比较多地侧重于蛋白质表达谱的研究上，对于在重要生理、病理过程中调控通路的蛋白质间的相互作用的研究有待深入研究。此外，蛋白质是在有机体内发挥生理功能的；而机体内存在着众多可与蛋白质结合的小分子物质，其中包括代谢产物。内源性代谢产物可能和蛋白质结合，从而改变蛋白质分子的空间构象和功能。因此，研究内源性代谢产物对蛋白质组的作用是进一步了解蛋白质在活体的功能是至关重要的，尤其是如能发现可直接与代谢产物发生相互作用的蛋白质，不但对于了解重要的生理、病理调节机制具有重要的科学意义，而且也将有助于蛋白质学的研究更加深入，更有望了解各重要生理、病理过程的机制；有望形成蛋白质组学
7、研究的一个分支，即小分子活性物质对蛋白质大分子结构和功能的调控。H2S是最近几年开始引起国内外学术界注意的内源性代谢产物。总体来讲国内外对该领域的研究尚处于起步阶段。通过本课题的研究，有望分析H2S与蛋白质之间的相互作用，发现相互作用的基本规律，揭示H2S调控若干重要心血管生理、病理过程的机制。其研究成果还有望对于蛋白质组学的进一步发展作出一定的贡献。（二）课题的特色和创新点心脏离子通道功能调节和血管新生是调节心脏生理功能和心脏缺血等疾病的重要调控通路，本课题组于2007年和2008年分别发现了H2S对上述两条心血管通路的调节作用。本课题组发现在心肌细胞中，H2S抑制心肌细胞膜L型Ca2+通道
8、的开放；在内皮细胞中，H2S促进细胞增殖、迁移、管腔形成以及在整体模型中的血管新生。但是H2S产生生物学效应的机制未被阐明，尤其是H2S直接作用的靶分子至今不明。本项目在前期工作的基础上，推定H2S直接作用的靶分子在心肌细胞是调控跨膜离子转运的Ca2+离子通道，或与其相偶连的信号分子；在内皮细胞直接作用于VEGFR2，或PI3KAktHIF-1生存素信号通路中的信号分子，在此有限范围中寻找H2S直接作用的靶分子。如能取得成功，对于揭示H2S这样一个小分子物质是如何调控大分子（靶蛋白）的空间构象和功能的具有重要的科学意义，可能会发现一种蛋白功能调控的新规律。首次应用代谢组学方法系统研究含硫氨基酸
9、及其衍生物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、SAC、SPRC等在体内的代谢途径，包括H2S及有关中间代谢产物。此外，针对缺血、缺氧性心脏疾病，特别是含硫氨基酸及探针药物SPRC进行生物化学，结构研究和代谢功能的研究，及上述代谢途径的变化。在此基础上，筛选和优化具有治疗前景的可以生成内源性H2S的化合物，并进行合理的结构改造。项目涉及的领域和技术非常多，预期在缺血、缺氧性心脏疾病的基础研究、临床治疗和医药开发方面取得突破性进展。首次通过裂殖酵母模式生物的基因组学和蛋白组学重点研究H2S对细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路的影响，结合用酿酒酵母的突变体库的筛选分离出H2S细胞效应信号传导通路中的多个重
10、要蛋白因子，找到这些重要蛋白因子在大鼠心肌细胞中的同源蛋白，进一步利用结构生物学，生物化学的方法研究蛋白之间，蛋白和DNA，RNA的相互作用机理，结合基因组学和蛋白质组学, 生物化学和分子生物学以及细胞生物学的结果，揭示H2S细胞效应的分子机制，阐明H2S在生理病理上的作用为新药设计及许多疾病的治疗提供新的思路。通过转基因小鼠技术构建携带CSE启动子控制的报告基因的转基因小鼠，从而在整体水平上实现对心脏中内源性H2S产生相关酶CSE在生理条件和病理条件下表达调控的实时观测和在体研究。阐明生理和病理条件下心脏内源性H2S产生的调控机制及调控网络，为通过药物干预心脏内源性H2S的产生奠定基础。阐明
11、体内H2S的传递途径及其作用的小分子，从而探讨H2S的分解代谢途径。利用转基因小鼠技术，实现对CSE表达的实时监测和在体研究。同时研究心脏内源性H2S产生的两条途径，既阐明各自的调控网络又研究两条途径之间的关联。既研究生理条件下内源性H2S产生的调控机制，又强调缺血、缺氧等病理条件下调控机制的变化。研究H2S与细胞内氧化性小分子和金属离子的反应特性，探讨内源性H2S的分解代谢。（三）课题设置课题1. 内源性代谢产物H2S对心脏细胞离子通道和血管新生通路的调控机制主要研究内容：离子通道和血管新生是与心脏生理、病理疾病密切相关的两条重要调节通路。本课题组首先发现H2S可影响上述两条重要调控通路，并
12、在前期研究中率先发现H2S可抑制心肌细胞膜上L型Ca2+通道的开放；可促进内皮细胞增殖、迁移、形成新的血管。在此基础上，我们拟深入研究H2S调控L型Ca2+通道与促血管新生的分子机制，确定H2S作用的关键靶蛋白，阐明其调控网络，为通过H2S途径干预心脏病打下基础。研究目标：1. 揭示若干H2S调控跨膜离子转运的重要通路，找到若干H2S直接作用的靶分子，深入研究H2S对其的调控机制。2. 找到H2S调控血管新生的直接作用靶点，深入研究H2S的调控血管新生机制。3. 发现H2S在不同靶分子蛋白上共同的可结合的位点或共有的化学修饰方式。课题承担单位：复旦大学；上海理工大学课题负责人：朱依纯 教授课题
13、参加人员：王睿、钱睿哲、付伟、卢宁、蔡文杰、王文伟经费比例：23课题2. H2S对真核细胞中蛋白质表达谱、蛋白间相互作用以及蛋白与核酸的相互作用的调控主要研究内容：H2S是最近发现的内源性信号分子，对细胞具有独特的调控作用。本课题以酵母为模式生物，通过基因组学和蛋白组学的方法，阐明H2S影响细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的信号通路，确定H2S作用的重要靶分子，绘制一幅完整的H2S细胞效应的信号通路图。将酵母中的研究结果进一步到心肌细胞加以验证。该工作有望全面系统的阐明H2S细胞效应的分子机制与调控网络，为通过H2S途径干预重大疾病找到新的靶点。研究目标：结合基因组学和蛋白质组学, 生物化学和分子
14、生物学以及细胞生物学的结果在裂殖酵母中绘制一幅完整的H2S细胞效应得信号传导通路图。分离出多个参与细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路中的重要蛋白因子，重点研究重要蛋白因子在各个信号通路中的作用机理，揭示H2S细胞效应的分子机制，为在哺乳动物中揭示H2S细胞效应的分子机制和阐明H2S在生理病理上的作用提供巨大的帮助和奠定基础。课题承担单位：复旦大学；南开大学课题负责人：Alastair Murchie 教授课题参加人员：陈东戎、Mark Gerrard Bartlam、王哲、王铭洁、霍克克经费比例：20课题3. 含硫氨基酸及其衍生物对心脏作用靶点及代谢途径研究主要研究内容：体内含硫氨基酸及从
15、食物中摄入的含硫化合物通过酶的作用分解代谢产生H2S，心脏中产生H2S的关键酶是CSE。本课题首次发现半胱氨酸衍生物SAC通过促进H2S生成而具有心血管保护作用。我们进一步合成了具有自主知识产权的半胱氨酸衍生物SPRC，其具有更好的心血管保护作用。在此基础上，我们拟通过代谢组学的方法，全面揭示含硫氨基酸及其衍生物（如SPRC）在体内的代谢规律，确定与含硫氨基酸及探针药物SPRC心脏保护作用密切相关的关键蛋白质，并对其功能进行深入研究。设计、优化、合成更好的具有药用前景的H2S供体化合物，为H2S供体药物的临床应用打下基础。研究目标：1. 阐明SPRC对心肌缺血保护作用的分子机制，鉴定出其作用的
16、关键蛋白，揭示其调控网络。2. 进一步优化SPRC的结构，设计合成出具有更好心肌保护作用的H2S供体化合物，为其临床应用奠定基础。3. 阐明含硫氨基酸和SPRC在体内的代谢途径，确定其代谢的关键酶，建立体内含硫氨基酸代谢途径研究的关键技术。4. 阐明缺血、缺氧病理条件下SPRC对心肌保护作用的机制和经由CSE的代谢途径，鉴定出其影响的关键蛋白质和信号通路，揭示SPRC对CSE是否具有反馈调节作用，从而发现干预心脏疾病病的全新靶蛋白。课题承担单位：复旦大学课题负责人：朱依谆 教授学术骨干：郭薇、林国强、储以微、赵伟利、孙逊、魏邦国、古险峰经费比例：34课题4. 心肌中局部内源性H2S生成调控及传递主要研究内容：以小鼠为模式动物，综合运用基因组学和蛋白质组学的方法，着
