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1、项目名称：细胞膜重要脂质代谢产物对重大疾病病理生理过程的调控首席科学家：朱毅 北京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容花生四烯酸被COX、LOX和CYP三条途径代谢生成上百种结构相似，但具有不同生物活性的代谢产物，在生命活动和多种重大疾病过程中发挥重要的作用。然而，许多重要花生四烯酸代谢产物的作用机制和关键的作用靶点等尚不完全清楚。特别是花生四烯酸代谢一条通路出现异常或者改变时，会如何影响其他代谢途径、会如何影响生物体的整体代谢，上述影响有什么病理生理学意义等重要问题仍然需要深入研究。另外，花生四烯酸代谢依赖几十种相关酶的共同作用，而上百种代谢产物与相应的蛋
2、白质（包括受体、信号分子等）结合和相互作用，共同介导了花生四烯酸系统对细胞和器官功能的影响。任何外界刺激或细胞功能状态改变导致的花生四烯酸代谢通路的改变，必然影响各通路代谢产物之间的稳态，进而造成细胞乃至机体的功能紊乱。本项目将现代生物学方法和转基因/基因敲除等模式动物相结合，横向研究在不同的生理病理状态下花生四烯酸代谢途径和产物的变化及其重要代谢产物与相关蛋白质相互作用的机制，进而阐明花生四烯酸代谢系统在不同病理生理状态下的作用。（一）关键科学问题：本项目针对“花生四烯酸代谢通路不同产物之间形成的网络、及其与相关蛋白质的相互作用机理、影响生物代谢组的规律以及对重要病理生理过程的调控作用机制”
3、等关键科学问题开展研究。（二）主要研究内容围绕我们提出的关键科学问题，根据前述的目前国际和国内研究现状以及我们具备的条件和前期工作基础，本项目以花生四烯酸代谢为中心，以代谢产物与相关蛋白相互作用和调节为主轴,针对花生四烯酸代谢产物在重要生理及病理生理过程中的调节作用，拟运用代谢组学、蛋白组学、结构生物学和模式动物结合的方法展开研究。本项目主要研究内容将在以下三个层面展开：1、阐明花生四烯酸的三大代谢通路中不同的代谢产物间的网络调控和代谢调节的关键因素，以及花生四烯酸代谢改变对整体和特定组织器官代谢组的影响（1）首先在细胞水平，研究环氧酶（COX-1和COX-2）、脂氧酶（5-LOX，12-LO
4、X， 15-LOX1和 15-LOX2）及P450单氧酶(表氧酶和w-羥化酶)三大代谢通路的代谢产物，以期明确花生四烯酸的所有活性代谢产物代谢谱的变化，并可望发现新的生物活性物质；（2）运用花生四烯酸三大代谢通路关键合成酶基因的敲除小鼠模型，借助代谢组学手段研究动物组织、血液和尿液中的花生四烯酸代谢产物以及整体代谢组的变化规律，以阐明单一通路阻断对其他通路代谢产物的影响；（3）在细胞和整体动物水平研究在单一代谢途径阻断的情况下，重要病理生理刺激因素对花生四烯酸代谢产物种类和合成水平的影响，以明确花生四烯酸不同代谢产物间的网络调控机制。2、重要的花生四烯酸代谢产物与相关蛋白的相互作用（1）利用结
5、构生物学和分子生物学手段明确COX及LOX产物与其相应膜受体结合的结构基础和介导不同信号通路的分子机制。该研究将有助于阐明同一花生四烯酸分子调节不同生理和病生理过程以及不同产物参与同一生理及病生理过程调节的分子基础； （2）研究花生四烯酸代谢产物与代谢性核受体相互作用的机制及其生物学作用，该项研究将可揭示花生四烯酸代谢产物通过核受体调控重要生理、病理生理过程的机制及与重大疾病的关系；（3）发现与重要花生四烯酸代谢产物（包括COX代谢产物前列腺素、前列环素、血栓素；LOX代谢物白三烯、5-HETE和15-HETE和CYP代谢物EETs和w/w-1-HETE）相互作用的新的蛋白分子，以阐明花生四烯
6、酸代谢产物参与重要生理及病生理过程调节的机制；（4）应用分子和细胞生物学手段在重要花生四烯酸代谢产物受体及其作用蛋白转基因或基因敲除动物模型中研究相应花生四烯酸代谢产物与相关蛋白质的相互作用及其机制。3、花生四烯酸代谢产物对重要生理病理过程的调控作用及其机制（1）在细胞水平研究重要花生四烯酸代谢产物对细胞增殖与分化、糖、脂代谢以及炎症过程等重要生理病理过程的影响及其机制；（2）在整体动物水平，利用模式动物和基因敲除动物研究花生四烯酸代谢产物与上述生理病理过程及其功能紊乱引起的相应重大疾病的关系。我们将本着“有所为，有所不为”的原则，以这些病理生理变化对心血管系统影响为重点展开研究；A. 以高脂
7、血症等疾病模式研究重要花生四烯酸代谢产物对脂代谢的影响和其代谢紊乱与高脂血症发生的关系；B. 以具有慢性血管炎症为特征的动脉粥样硬化为切入点，探讨花生四烯酸代谢产物调控血管内皮细胞功能，参与对动脉粥样硬化发生、发展的机制； C. 心血管细胞的损伤与重塑发生是细胞增殖与分化失衡的结果。以高血压、心肌肥大及内膜新生为模型，研究不同花生四烯酸代谢产物在心肌细胞和血管平滑肌细胞中对细胞增殖与分化的影响。上述研究的完成不仅将完善我们对花生四烯酸活性产物复杂网路调节的认识，也有助于明确花生四烯酸代谢产物调节重要病理生理过程的机制和分子基础；也将有助于阐明花生四烯酸对人类重大疾病（高血压、动脉粥样硬化和心肌
8、病）病程的影响。上述研究的完成也将可能发现一些花生四烯酸代谢的新产物或新功能，为干预上述重要病生理过程和相关疾病提供潜在的药物靶点。二、预期目标（一）总体目标：本项目旨在以花生四烯酸代谢与重要生理病理过程调节为重点，通过组学研究与模式动物研究相结合的多中心、跨学科的联合研究，整合国内优秀团队，砺练一支花生四烯酸代谢相关研究的队伍，进一步完善相关的研究体系，为我国在这一重要研究领域跻身国际先进行列提供基础和条件。我们预期在今后5-10年内逐步阐明花生四烯酸在不同的生理、病理状态下代谢的规律以及不同代谢途径间的相互关系；在该领域获得突破，并在国际上处于领先水平。确定重要的花生四烯酸代谢物与蛋白质和
9、受体的相互作用及机制、引起的信号和网络调节的变化，这些小分子化合产物及相关联的蛋白分子在生理和病理生理网络调节中的位置等。明确重要的花生四烯酸代谢产物在细胞增殖、分化、炎症等重要生理病理过程中的作用，分子机制和关键的作用靶点；在基于花生四烯酸代谢产物的自主创新的药物开发，和某些重大疾病的诊断标志等方面获得一批有自主知识产权的重要成果；为疾病治疗提供理论基础和潜在靶点，从而为下一步研究疾病的防治策略、治疗决策和新药开发提供依据。（二）五年预期目标：在项目资助的五年内，我们拟实现以下目标：1. 阐明干预花生四烯酸单一代谢通路引起的整体代谢产物的相互消长关系、调节网络和其介导的主要病理生理学功能；2
10、. 阐明花生四烯酸代谢通路和代谢产物在几个重大疾病（动脉粥样硬化、高血压、血管再狭窄和心衰）的病理生理过程中的作用靶点和机制；3. 以重要花生四烯酸代谢产物为探针分子研究它们在重要心血管疾病中的作用，揭示花生四烯酸代谢产物与相关疾病发生关系，为发现具有潜在应用价值的药物靶点奠定基础； 4. 完善和加强代谢组学技术平台以及花生四烯酸代谢相关的转基因小鼠和组织特异性基因敲除小鼠等模式动物平台；运用几种重要的花生四烯酸代谢酶基因和几个重要的代谢物受体转基因或基因敲除动物，完成在非干预状态下和不同干预状态下重要组织器官基因表达谱和蛋白组学研究。5. 发现10-20个重要的调节或功能蛋白，着重研究和阐明
11、其中5-10种重要蛋白的作用和在调节网络中的作用和位置；6. 针对花生四烯酸代谢相关的酶、受体、作用靶点，建立专门的基因芯片和蛋白质芯片，用于课题模式动物和细胞基因和蛋白质表达变化的筛选；7. 在国际主流期刊发表高质量论文60-80 篇，申请国内外专利 10-15 项，申报国家奖励2-4项。三、研究方案总体研究方案（一）学术思路：以花生四烯酸代谢为中心，以代谢产物和相关蛋白质相互作用和调节为主轴,针对它们在重要病理生理过程中的调节作用，运用现代生物学（组学、结构生物学、生物信息学）和模式动物结合的方法展开研究。在总体研究方案有如下几个层面：1、在课题的选择上，我们选择花生四烯酸这一分布广泛、其
12、代谢产物复杂且有重要生理病理作用，但作用机制还远未阐明的小分子化合物为研究对象。选用现代生物学方法和转基因/基因敲除等模式动物相结合，横向研究在不同的生理、病理状态下代谢途径，内源性代谢产物的变化及与相关蛋白质相互作用机制；2、在第一个层面，我们将在三大代谢途径的代谢酶基因和几个重要的花生四烯酸代谢物的受体转基因或基因敲除的细胞模型中，研究基因和代谢产物所致的代谢组和蛋白组变化。结合模式生物学手段研究当一条通路，一个酶活性发生改变时，其他通路和酶的变化，代谢产物的稳态的改变以及整体代谢组改变。以期发现代谢产物与相关酶的相互作用，以及代谢产物在重要生物调控网络中的作用及其机制。3、在第二个层面，
13、研究花生四烯酸代谢产物与受体及转录因子等相关蛋白的相互作用机制和调控功能。重点研究不同的代谢产物对代谢性核受体重要信号转导途径的调控作用及其空间结构和生物学功能的影响；同时研究与糖、脂代谢调控相关的代谢性核受体和转录因子等对花生四烯酸代谢的调控机制。4、在第三个层面，研究花生四烯酸三条代谢途径的代谢酶和主要代谢产物在细胞增殖与分化、细胞激活和炎症、糖脂代谢紊乱等重要的病理生理过程中的作用。以心血管系统改变为代表，利用重大疾病如高血压、动脉粥样硬化、糖脂代谢紊乱和心力衰竭等疾病的动物模型和细胞模型，研究发生这些效应的同时蛋白质组和代谢组的变化规律。（二）总体技术路线按照上述总体思路，本项目利用多
14、种模式动物研究不同基因缺陷和高表达增强后的表型变化。首先在细胞水平通过高表达或沉默相关基因及直接加入相关代谢物（如PGE2,HETEs,EETs等）验证实验结果并进行机制研究；进而进行基因组、蛋白组学研究和机制研究，明确重要蛋白在整个组学变化中的位置、调节作用和作用机制；然后是研究主要花生四烯酸代谢物在重要疾病中的病理生理作用，确定关键作用靶点。具体用以下模式图表示。图2.总体技术路线（三）研究特色和创新性1、凝练出明确的科学问题和研究思路-以花生四烯酸通路为主轴，将花生四烯酸代谢作为一个整体进行研究：本项目首次将花生四烯酸代谢产物这一作为体内多种小分子活性物质的前体物质、在生物体内广泛存在且
15、含量丰富的物质作为一个整体进行研究。与目前的单一产物，单一酶和单一通路研究不同，我们利用组学分析和生物信息学方法主要研究三条通路间的交互作用、三条代谢通路间的平衡与调节； 2、跨学科整合，优势互补、组学研究与模式动物结合：本项目的研究人员由高校长期从事花生四烯酸代谢与疾病研究的教授和科学院具有代谢组学和结构生物学研究经验的专家组成。研究队伍具有明显的优势互补性。研究将利用先进的技术手段，包括高通量基因和蛋白质芯片技术、蛋白组学技术、代谢组学和生物信息学技术和各种模式动物，这将大大提高工作效率和获得更多、更可靠的信息；对代谢性核受体和转录因子的结构生物学研究不仅可以揭示蛋白质的功能和作用机制，而
16、且可以为设计活性小分子作为激活剂和抑制剂提供理论依据；3、探索新的研究模式与建立新的技术平台系统：因为花生四烯酸代谢产物既能够调控代谢性核受体和转录因子的生物学功能，反过来又是代谢性核受体和转录因子所调控酶的底物或产物，因此它们之间的相互作用是一种典型的反馈调控模式。本项目将动态而全面的研究蛋白质与代谢产物的相互作用。采用上述多种新的技术和模式动物对花生四烯酸代谢产物效应进行立体的研究和发掘、全方位研究其引起的蛋白质组学变化、在网络调节中的作用；分析这些代谢产物并发现新的产物及其靶分子，研究相关作用机制，确定其在网络调节中的位置和发现关键环节；4、研究内容明确，各课题组间关系密切、分工协作：由于花生四烯酸代谢物有共同和基本的结构，不同的课题组研究的分子效应和靶点可能交叉融合，因而能获得更全面和准确的信息。项目利用
