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1、项目名称：靶向基因治疗的应用基础研究首席科学家：魏于全 四川大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 四川省科技厅一、研究内容本项目将围绕基因治疗目前面临的困难，在前期研究工作的基础上，从新型靶向病毒载体、新型高效的靶向非病毒载体、靶向选择表达调控、定点整合和原位修复、靶向基因沉默等基因治疗的关键科学问题入手，试图解决基因治疗的瓶颈问题靶向性。并将这些可能取得的技术突破用于肿瘤、艾滋病、遗传病、心血管疾病等严重危害人类健康的重大疾病的治疗研究中。为推动我国基因治疗基础研究和临床实践的发展，巩固我国基因治疗研究在国际上的地位，也为我国基因治疗药物产业的发展提供关键技术支撑。主
2、要研究内容包括： 1 病毒载体的靶向性研究构建器官组织靶向的病毒载体或溶瘤病毒，提高病毒载体对靶细胞的亲和性，使得病毒载体能够在靶器官或肿瘤组织局部富集，从而大大提高目的基因的表达水平；尽量降低病毒载体的免疫原性，减少免疫系统对病毒的清除，从而降低病毒的用量，提高安全性。2 非病毒载体的靶向性研究制备各种新型可降解、安全性好的脂质体材料或多聚物载体材料，将各种靶向的配体或抗体连接于材料的表面，赋予其主动靶向性；用这些靶向材料负载目的基因，研究其体外包裹效果和体内靶向效率，研究其药代动力学性质及安全性、有效性。3. 定点整合、原位修复技术及机理研究提高噬菌体C31/BT1整合酶介导的整合位点特异
3、性和整合效率，阐明rep蛋白介导的位点特异性整合影响因素，研究单链DNA寡核苷酸（SSO）介导的基因原位修复的机理和AAV ITR/REP介导外源基因定点整合到19号染色体AAVS1的机理和应用，研究人源基因载体在靶向基因治疗中的应用。4选择性表达调控研究利用基因组学和蛋白质组学已有成果，筛选各种可受理化因素调控的转录因子和调控元件，研究其中有功能、可调控的结构域；构建靶向调控表达的各种病毒系统或原核表达系统，研究其靶向效率、表达调控的效果和安全性、有效性，最大程度地降低目的基因对正常组织器官的影响。5RNA干扰、microRNA等靶向基因沉默技术及在基因治疗中的应用研究利用RNA干扰或mic
4、roRNA等新型基因沉默技术探讨靶向基因治疗的新途径，特别是针对具有潜在治疗价值的新靶点、新基因的研究。6靶向基因治疗技术在重大疾病的应用研究所有靶向性的研究，所有新技术的探索，最终的目的只有一个，就是为了治疗人类的重大疾病，保障人类的健康。利用以上技术的发展和突破对遗传病、艾滋病、肿瘤、心血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病进行治疗，探讨靶向基因治疗的应用，也同时验证我们所发展的靶向基因治疗的新技术、新方法和新策略能否最终解决或部分解决基因治疗的安全性、有效性问题。二、预期目标总体目标： 在“973”计划项目的资助下，通过努力在靶向基因治疗的基础理论和几大关键技术方面取得突破和创新，包括增强
5、导入系统、定点整合、原位修复、表达调控、基因沉默等基因治疗关键环节的靶向性和效率；完善具有我国自主知识产权的靶向基因治疗系统和技术平台；为推动我国基因治疗进入临床应用提供可靠的理论依据和关键技术支撑，提供多项具有潜在应用前景的靶向基因治疗候选新药或治疗方案。进一步提升我国在基因治疗领域的国际地位。五年预期目标: 在病毒载体的研究方面，要在新型高效、低毒、靶向导入的病毒载体研究上有关键技术的突破；提供2-3个可供基因治疗临床应用的靶向性、低免疫原性腺病毒载体；提供2-3个可供基因治疗临床应用的、在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒载体；2个以上可用于基因治疗临床应用的、具有不同亲嗜性和组织表达特异性的
6、AAV载体。在非病毒载体的研究方面，制备出新型稳定的靶向脂质体载体、新型可降解靶向的聚合物胶束载体等，解决制备工艺的稳定性，并建立相应的质控标准。同时研究载体-基因药物复合物在体内的靶向分布，潜在的毒性以及治疗效果。最终提供3-5种安全有效的可供基因治疗临床应用的非病毒载体。在定点整合和原位纠错研究方面，有理论创新和突破，初步揭示整合酶与顺式元件的结构和功能的关系，研发出3-5个新的定点整合载体体系。筛选并建立集高效性、安全性于一体的位点特异载体系统。对寡核苷酸分子定点修复的机理取得更深入的认识和突破，进一步提高修复效率，为其临床应用提供理论依据。建立一个以“人源基因载体”为核心、自体干细胞为
7、靶细胞的“自体化”靶向基因治疗新体系。在靶向选择表达调控方面，构建肿瘤、组织细胞及病毒特异的表达调控元件库，深入研究基因表达调控的机制。提供2-3个可供基因治疗临床应用的、在靶细胞内选择性表达调控的腺病毒及其它病毒载体。发展RNA干扰、microRNA等基因沉默新型治疗系统，进一步发展和应用靶向性，并把靶向策略和新型导入系统应用到RNA干扰技术中，提高治疗效果。提供2-3种具有临床应用前景的抗肿瘤或抗传染性疾病的干扰药物。对遗传病、艾滋病、肝炎、恶性肿瘤、心血管系统疾病等重要疾病进行基因治疗研究，并进一步验证以上研究的关键技术的应用可行性。由基础研究突破，进而推动了我国基因治疗药物的发展，提供
8、具有潜在应用前景的靶向基因治疗候选新药或治疗方案10余项。培养基因治疗基础及应用研究方面的学术带头人和学术骨干15-20人，培养一大批懂得基因治疗的研究生，为基因治疗及国内健康事业的可持续发展补充后备力量。论文：发表SCI收录的论文200篇以上，其中IF5的应占40%以上，力争3-5篇论文发表在Nature或Science上。专利：申请专利50-100项，其中国际专利5-10项。三、研究方案总体思路： 本项目采用一种新的理念即系统工程的概念来解决基因治疗中存在的关键问题。以基因治疗的靶向性为重点，围绕五个关键科学问题，从基因的输送、定点整合或原位修复、表达调控等几个层面入手，一环紧扣一环。各课
9、题似“部件”或“元件”，相辅相成，有机组合成一个整体，最终创建出比较理想的基因治疗系统，进行遗传病、艾滋病、肿瘤和心血管病等重大疾病的基因治疗。本项目中的每一个课题都是在具有独立知识产权的、原创性工作的基础上的进一步拓展，每一个课题的突破都将带来基因治疗研究的进步，不仅能解决或阐明目前基因治疗中迫切需要解决的理论问题及关键技术，还能为临床应用提供技术支撑和潜在的产品。技术路线： 本项目技术途径涉及到多学科多技术的交叉应用，主要通过利用现代基因工程和分子生物学技术、新型材料技术，结合细胞生物学技术、实验动物技术来实现。包括运用基因工程和分子生物技术实现对病毒载体的改造赋予其细胞吸附和转运进入细胞
10、的靶向性或特异复制靶向性；运用材料学技术合成新型的靶向脂质体、PEI等新型材料，并与靶向配体偶联，赋予非病毒载体靶向性；改造病毒载体和质粒等非病毒载体，用靶向调控元件替换其非靶向元件，结合双基因甚至多基因表达等，实现基因在靶向器官或组织细胞中的特异性表达或者定点整合、原位修复。再用常规的检测技术、细胞培养技术、实验动物技术观察靶向导入系统对目的基因的靶向输送情况，目的基因的靶向表达情况，体外对肿瘤细胞、致病病毒复制情况等的影响，以及体内对各种重大疾病模型动物的治疗效果和毒副作用等，考察我们的研究成果是否取得突破以及潜在的临床应用价值。可行性分析： 如上所述，本项目以增强基因治疗的靶向性为核心，
11、解决基因治疗中的安全性和有效性问题，实现一批关键技术的突破，探讨这些新技术、新方法在遗传病、艾滋病、肿瘤和心血管疾病等的潜在应用。目标明确，课题设置合理，技术路线先进。项目的八家承担单位都是国内从事基因治疗研究的国家重点实验室，拥有项目所需要的各种技术平台和价值上亿元的先进仪器设备。项目的研究队伍聚集了国内长期从事基因治疗研究的优秀人才，有良好的合作基础。本项目是上一期项目的延续实施和进一步深入。通过上一期项目的实施，已发表基因治疗相关的SCI论文200多篇，包括在国际权威的Nature系列杂志上文章3篇，PNAS、Mol Pharm、MCP、Hepatology、EMBO J等影响因子9以上
12、的文章18篇，影响因子5分以上的文章60余篇，获准专利授权20余项，为本项目奠定了很好的基础。通过上一期项目的实施为本项目凝练出了目标和重点，使得本项目的研究方向更明确，重点更清晰，对困难的认识也更充分，因而可以更好地配置力量和资源，集中力量攻克重点和难点。上一期项目还为本项目建设好了所需要的技术平台和技术路线。因此，无论是研究基础、经验、人员、技术等软件条件，还是仪器设备等硬件条件，项目组都已经具备，能够保障项目的顺利实施和圆满完成。创新点与特色： 在总体设计上目标明确，重点突出，凝练出基因治疗领域的关键科学问题，以增强基因治疗的靶向性为核心，提出我国学者自己的学术观点，设计具有自主知识产权
13、的基因治疗载体或系统，利用适当的细胞和动物模型，评价其作用效果，并深入研究相关的作用机制，为推动我国基因治疗基础理论研究的发展和基础科研实力的提高，为基因治疗的临床应用奠定坚实的基础。 整个项目的设计以基因治疗的靶向性为核心，从基因的输送和导入、定点整合或原位修复、表达调控等几个基因治疗的关键层面入手，一环紧扣一环，每个层面都围绕着靶向性这一核心，层层推进，形成一个有机的整体，体现了研究的系统性和整体性。 以遗传病、肿瘤、艾滋病、心血管疾病等重大疾病为治疗目标，所有策略、技术研究的目的都是为了在这些疾病的治疗上取得进展和突破。这些疾病是严重危害人类健康的重大疾病，也与我国的健康事业发展息息相关
14、。体现了我们项目紧密围绕国家和社会需求，将基础研究与临床实践和应用相结合的特色。 在靶向性策略上，我们采用的技术路线都是我们首创的具有自主知识产权的方法或是目前国际上研究的热点，并且已经有了很好的研究基础。上一期工作中我们在几种靶向策略上都有创新性研究，并已取得了显著的成绩和部分突破。例如我们首创的肿瘤靶向双基因-病毒治疗，既利用了病毒的靶向复制溶瘤，又能将抗肿瘤基因的效应扩大成百上千倍，能将肿瘤细胞彻底清除，相关文章发表在Hepatology、Cancer Research、Mol Therapy等杂志，并已申请了国际专利；在寡核苷酸介导的基因原位修复研究方面，首次提出了复制叉渗漏SSO掺入
15、修复假说，研究论文发表在PNAS杂志；首次发现了人类的核糖体基因区人D、G组染色体短臂可以作为人类基因治疗的最佳靶位点，成功构建了人源基因载体将目的基因靶入到人核糖体基因（rDNA）区，并能安全、有效和长期稳定表达，该研究已获美国专利授权；我们还利用从抗体库筛选获得一株具有内化活性的抗HBsAg单链抗体与鱼精蛋白片段融合，建立了siRNA靶向输送系统，并在体内外实现了siRNA向HBV感染细胞的靶向特异性输送，相应结果发表在Hepatology上。本项目中我们将在这些创新成果的基础上进一步深入地开展研究，取得新突破的可能性很大。 本项目是多学科的交叉，以基因工程、分子生物学、病毒学、免疫学、细
16、胞生物学、化学、材料学等多学科为基础，服务于医学的需要。研究人员来自于临床医学、基础医学、生物学、化学、材料学等不同的学科领域，组成联合攻关团队，瞄准重大疾病的治疗需求和产业化需求，集中优势力量解决目前基因治疗面临的靶向性难题。 本项目的承担单位都是国家重点实验室，有长期从事靶向基因治疗的研究基础和经验，有优秀的研究团队，已建设了本项目需要的很好的技术平台并拥有价值上亿元的精良的设备。 本项目是上一期项目的延续，不仅有很好的研究基础，还有良好的团队协作基础和管理经验。以前的合作能够创造佳绩，相信更能为以后更大的成功奠定基础。课题设置本项目以基因治疗的靶向性为核心出发点，根据需要解决的6个关键科学问题，设置了6个课题，即：(1) 新型靶向病毒载体研究(2) 新型靶向非病毒载体研究(3
