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1、项目名称：生殖细胞基因组结构变异的分子基础首席科学家：金力 复旦大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：上海市科委 教育部一、关键科学问题及研究内容1、拟解决的关键科学问题：在人类生殖细胞的形成过程中（包括生殖干细胞的有丝分裂和生殖细胞的减数分裂），基因组会产生多种变异；其中，基因组结构变异（SV）是人类生殖与发育相关疾病的重要致病因素，也是个体间遗传差异的主要形式之一。本项目成员的前期研究发现，SV可以来源于生殖细胞形成过程中的DNA复制、同源重组、DNA损伤修复、染色体的错误分离等多种途径，在神经发育异常、先天性心脏病、男性不育症等多类生殖与发育相关疾病中有重要致病作用。但是，S
2、V在生殖细胞发生过程中是如何突变产生的？有何特征与规律？其致病机制有哪些？SV对人类群体生殖健康的作用是怎样的？这一系列科学问题仍未解答。因此，本项目拟解决的关键科学问题是：人类生殖细胞基因组SV突变的分子机制及其在个体和群体水平上的生物学效应。2、主要研究内容：针对上述要解决的关键科学问题，我们将主要开展以下四个方面的研究。其中，生殖细胞基因组SV的特征与突变机理研究针对子问题“生殖细胞基因组SV突变的分子机制”，生殖细胞基因组SV的致病机制与群体效应研究针对子问题“生殖细胞基因组SV在个体和群体水平上的生物学效应”。1）生殖细胞基因组结构变异的特征研究生殖细胞基因组稳定性及其遗传变异研究的
3、一个瓶颈是SV突变事件的发现和鉴定。即便基因组SV的突变率高，一个精子和一个卵子结合之前在全基因组范围新产生的SV一般也仅有一个或者数个，不利于研究材料的积累。对SV多发的各类生殖与发育疾病的研究，可以突破上述研究瓶颈。在神经系统发育缺陷（例如，智障）和器官组织的发育缺陷（例如，DMD），新发生的SV是重要的致病因素之一，已知的由致病性SV导致的病例可以占到总病例的20%；并且，随着研究技术分辨率的提高，这一检出率还在不断上升。本项目基于前期工作对致病性SV的研究基础，拟通过全基因组SV分析和定点的定量分析等技术手段相结合，鉴定生殖与发育疾病中的由生殖细胞基因组变异产生的致病性SV，并进行深入
4、的SV特征研究。主要研究：(1) 选择与生殖细胞基因组SV相关的出生缺陷为切入点，包括：智障、DMD等，并同时采集核心家系，用于进行病例与其父母的基因组比较分析；(2) 应用高分辨率的比较基因组杂交芯片、特定SV位点的拷贝数定量分析等技术手段，发现SV变异并通过家系内的比较分析鉴定生殖细胞形成过程中新发生（de novo）的基因组SV；(3) 研究和总结由生殖细胞基因组变异导致的各种致病性SV的结构、基因组上的分布规律、突变热点等特征；(4) 通过对SNP和STR等人类基因组遗传标记在家系内的传递信息，确定SV的亲代来源，探索在精子和卵子的发生过程在基因组SV中的相对贡献。2）生殖细胞基因组结
5、构变异的突变机理生殖细胞基因组的重排过程可以由不同的分子机理介导。已知的可以导致SV的突变机理模型有多种，产生具有不同结构和序列特点的SV。SV的结构特征即简单SV和复杂CNV；SV断点序列特征包括：微同源序列，SINE/LINE，无同源序列等多种形式。本项目将研究人类生殖细胞形成过程中基因组SV的突变机理，探讨DNA损伤后引起的基于DNA重组（例如，NAHR和BIR等）及DNA复制（例如，FoSTeS和MMBIR等）的突变机理模型在基因组SV形成过程中的作用。主要研究：(1) 利用覆盖全基因组的SV分析方法以及定点的高密度SV检测方法研究“研究内容一和内容四”中鉴定得到的SV，解析其精细结构
6、及特征，发掘其它低分辨率技术无法检测到的SV复杂结构；(2) 基于高密度SV分析结果，进行SV断点序列的特异性扩增，利用DNA测序技术将SV断点确定到单个碱基水平，并研究其序列特征；(3) 基于大样本、高通量数据的断点和结构特征分析，检测已知的基于DNA重组与DNA复制的不同突变机理在生殖细胞SV中的贡献，并在积累的大量新数据的基础上，研究和揭示新的SV突变模型；(4) 研究人类基因组重复序列的组成特性对生殖细胞减数分裂过程中非等位同源重组的影响，探索人类基因组的特殊结构与其不稳定性之间的关联；(5) 追溯基因组SV的突变起源（生殖干细胞的有丝分裂或生殖细胞减数分裂阶段），用以指导相关生殖和发
7、育疾病的产前诊断。3）生殖细胞基因组结构变异的致病机制基因组SV与人类疾病密切相关，特别是在出生缺陷中高发。同时，部分在人群中常见的SV对人体生理功能及性状有重要影响。但是SV的致病机制仍未被阐明清楚，相关研究报道较少。已有的SV致病的分子机制模型主要有：基因失活、剂量效应、基因融合、位置效应、二次突变等。这些机制或者假说为我们进行生殖细胞基因组SV发现后的致病机制研究提供了理论指导。主要研究：(1) 针对“研究内容一”中鉴定得到的出生缺陷等常见生殖与发育疾病中的致病性SV以及“研究内容四”中发现的中国人群中常见的SV变异，基于基因组SV的断点序列分析数据，确定SV中涉及的单个或者多个功能性基
8、因；(2) 根据SV的变异形式，在“基因失活、剂量效应、基因融合、位置效应、二次突变”等机制的理论指导下，针对不同SV提出合理的SV致病机制假说；(3) 借助于基因表达分析、基因过表达或基因敲除、斑马鱼等模式动物、体外细胞培养及功能鉴定等技术手段，进行SV致病机制假说的检验；(4) 研究生殖细胞基因组SV导致生殖与发育疾病的分子机制。4）生殖细胞基因组变异在中国人群中的群体效应生殖细胞的基因组发生变异之后，除了直接的致病性导致包括生殖与发育疾病在内的多种先天性疾病之外，也可以作为一类常见变异存在于人群中，是人类基因组遗传多样性的重要形式，并影响人体的生理功能及性状，可能和人类常见疾病相联系。因
9、此，生殖细胞SV的群体效应是SV的生物学功能和致病作用的重要组成部分。此外，本项目“研究内容一”选择SV高发的相关疾病为切入点，突破生殖细胞SV突变难以发现和鉴定的瓶颈；但同时，也可能会造成后续的SV突变机理与生物学功能研究的偏向性。因此，本“研究内容四”将纳入中国人群中较为常见的SV，检验生殖细胞基因组SV突变后的长期的群体效应。主要研究：(1) 选择具有代表性的基因组SV多发的人类17号常染色体和X性染色体为主要研究模型，利用高分辨率的基因组学技术进行大样本量和高密度的基因组SV分析和鉴定；(2) 利用人类群体的基因组学数据，在全基因组水平进行系统的SV变异分析，研究SV的性质和分布规律；
10、(3) 借助于基因组连锁不平衡的规律与SNP信息，在群体水平上估计SV发生的突变率；(4) 研究人类基因组上减数分裂重组的热点及其序列或结构特征，探索热点区域形成的分子基础；(5) 利用群体遗传学分析手段，结合“研究内容三”的SV生物学功能研究，系统地揭示生殖细胞基因组SV所产生的群体效应，探讨SV对人类性状的多样性、自然选择、环境适应、以及人群健康的重大意义和作用。二、预期目标1. 本项目的总体目标：以基因组SV高发的出生缺陷病例及其家系为切入点，突破生殖细胞基因组SV新发生突变难以鉴定的瓶颈，同时结合中国人群中常见的SV，综合遗传学、生殖医学、细胞生物学、人类生物学、生物信息学与系统生物学
11、等现代生命科学研究手段和工具，研究生殖细胞的发生过程中基因组SV的特征、突变机理、致病机制、以及群体效应，揭示生殖细胞基因组稳定性的重要作用和意义，在解答科学问题和取得理论突破的同时，指导SV相关生殖与发育疾病的分子诊断与防治。通过本项目的实施，预计将在以下几个方面取得突破：(1) 系统阐明生殖细胞减数分裂与生殖干细胞有丝分裂中产生SV突变的分子机理，为相关生殖与发育疾病的诊断和防治提供理论基础；(2) 深入揭示生殖细胞基因组SV的生物学效应，解析相关疾病的致病机制及其群体效应的分子基础；(3) 建立具有国际竞争力的创新型研究团队，并培养一批优秀中青年人才，使我国在生殖细胞基因组稳定性研究进入
12、国际前沿。2. 五年预期目标:在已有的前期工作与成果发现的基础上，选择生殖细胞基因组SV这一新的学术增长点为突破口，研究其在生殖细胞发生过程中的突变机理、在人类疾病中的致病作用、以及在人群中的群体效应，使我国在生殖细胞基因组稳定性研究领域进入国际领先水平。项目的具体预期目标包括：(1) 在SV相关的出生缺陷中全面发现由生殖细胞发生过程中产生的基因组SV，建立一个具有可扩展性和可移植性的疾病相关SV的信息和特征数据库；(2) 研究已知机理模型在生殖细胞基因组SV突变中贡献的同时，探索具有特殊结构的SV，发现1-2类未知的SV突变新机理；(3) 建立细胞水平的和模式动物（例如，斑马鱼）水平的SV功
13、能研究方法； (4) 通过生殖细胞基因组SV突变途径的不同特点，完善相关疾病的分子诊断和产前诊断技术； (5) 建立中国人群的高密度基因组SV突变谱，揭示生殖细胞SV突变的群体遗传规律； (6) 课题有机地紧密联系、充分利用团队优势开展协作，取得生殖细胞基因组SV相关的重要科研成果和突破，发表高水平论文50篇以上；(7) 通过高质量的基础研究训练来提高研究生和博士后的科研素质，培养学术带头人2人以上，研究生60人、博士后5-10人，为我国生殖细胞基因组稳定性及健康研究储备后备人才。三、研究方案1. 学术思路生殖细胞基因组的稳定性对于人类生殖健康和子代发育至关重要。在生殖干细胞的有丝分裂和生殖细
14、胞的减数分裂过程中，基因组结构变异（SV）突变率高、变异程度大、覆盖面广，是各类生殖与发育相关的先天性疾病的重要致病因素。研究SV的突变及致病的分子机制具有重大的科学意义与临床应用价值。但是，现阶段的相关研究遇到了生殖细胞中新发生基因组SV难以鉴定的瓶颈。本项目以基因组SV高发的出生缺陷疾病家系及大规模人群研究为切入点，主要利用我们已经建立的高密度比较基因组杂交芯片分析等先进技术平台，对长期积累的丰富的SV相关病例资源进行全面的家系分析和群体分析，突破生殖细胞基因组SV新发生突变难以鉴定的瓶颈，系统高效地鉴定生殖细胞基因组上产生的SV，为研究其突变机理及致病机制提供大量的分析材料，并揭示精子与
15、卵子基因组稳定性对生殖健康的相对贡献，在解答科学问题和取得理论突破的同时，指导SV相关生殖与发育疾病的分子诊断与防治。2. 技术途径和总体技术路线本项目从出生缺陷病例及家系、大规模的中国人群入手，通过高密度CGH芯片等全基因组SV分析手段以及定量PCR、FISH等定点SV分析手段相结合，鉴定生殖细胞发生过程新产生的基因组SV以及可通过生殖细胞遗传的SV。课题一还将对SV的结构和重排模式进行解析，研究SV的变异特征，并揭示精子和卵子的发生对生殖细胞基因组SV突变的贡献。课题二以DNA重组、错误复制等理论假说为基础，通过序列捕获和高通量测序等技术，研究SV突变的分子机理，阐明生殖细胞减数分裂重组和
16、生殖干细胞有丝分裂等过程在SV突变中的作用。课题三根据SV的结构特征提出SV发挥生物学功能的可能的途径，借助于细胞模型、斑马鱼模式动物模型、基因体外操作和调控技术等，模拟和检验SV致病的分子机制假说。课题四除了对中国人群进行基因组规模的SV分析之外，还将利用精子分型技术对SV的突变率进行检测，同时借助于群体遗传学手段，研究生殖细胞基因组SV产生后的群体效应，服务于人群的生殖健康。3. 创新点与特色关键科学问题的前沿性：新近大量发现的人类基因组SV的突变率高、变异程度大、致病性强，是近年生命科学研究的热点。生殖细胞基因组上新发生的SV被认为是各类原因未明的先天性疾病的重要致病因素，对这一前沿问题的进一步探索有望取得重大突破。本项目以我国优生优育的生殖健康重大需求为导向，瞄准基因
