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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 激酶信号转导通路在缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞增生中的作用作者：兰兰，王雨生，王耀春，张鹏【摘要】 探讨磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)在缺氧诱导的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞增生中的作用。方法：利用 CoCl2 法建立培养细胞缺氧模型。在缺氧条件下培养人 RPE 细胞 1，4，8，12 和24h，流式细胞仪检测 RPE 细胞的增生活性，RT-PCR 和 Western blot 检测磷酸化 PI3K mRNA 和蛋白的表达水平。用
2、 30mol/L PI3K特异性阻断剂 LY294002 处理 RPE 细胞，作为阻断实验组。结果：随缺氧时间延长，RPE 细胞增生活性逐渐增高，磷酸化 PI3K mRNA和蛋白表达水平逐渐增高。LY294002 处理组较对照组 RPE 细胞增生活性显著降低(P 0.05)。论：缺氧诱导的 RPE 细胞增生部分是通过 PI3K 信号转导通路实现的。【关键词】 磷脂酰肌醇 3-激酶0 引言在年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)眼内，由于脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)生成，继发一系列渗
3、出、出血和瘢痕形成等改变，导致患者视力明显下降，甚至丧失。实验及临床研究表明，CNV 的发生与脉络膜局部缺氧有关1。在 CNV 的发生过程中，人视网膜色素上皮(retinal KKME-专业医学搜索引擎 http:/ epithe- lium, RPE)细胞起着重要的调控作用。在缺氧条件下，RPE 细胞通过诱导各种细胞因子的释放，引起包括血管基底膜的降解、血管内皮细胞(endothelial cells, EC)的增生、趋化和移行以及新基底膜的沉积等一系列反应，最终导致新生血管管腔的形成2。由于 CNV 的形成是多种分子共同作用的结果3，而分子间的相互作用又错综复杂。因此，寻找一个能够调控 R
4、PE 细胞生长的关键信号通路可能对于防治 CNV 具要重要意义。近十几年研究发现，磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)是一种与细胞信号转导有关的酯类第二信使，广泛参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节、细胞增生、分化，抑制细胞凋亡等一系列与生命现象密切相关的过程，从而提示 PI3K 在细胞增生过程中起到十分重要的调节作用4。但是该信号转导机制在 RPE 细胞增生中的作用尚不十分清楚，我们对此进行了初步的探讨。1 材料和方法1.1 材料 人 RPE 细胞取自角膜移植术后供体眼球，分离、培养及鉴定方法同前5,6，第 47 代细胞用于实验。将
5、RPE 细胞以 1106 个细胞接种于 10cm 的培养皿中，培养 72h 后更换为无血清培养基(serum-free medium, SFM)培养。实验分阻断剂处理组和对照组。处理组加入阻断剂 LY294002 30mol/L(美国 Cell Signal 公司)，作用 1h 后，处理组和对照组分别加入 CoCl2 200mol/L 以建立RPE 细胞化学缺氧模型。继续培养 1，4，8，12 和 24h 分别用于以下检测。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 方法1.2.1 细胞增生指数的检测 消化、收集 RPE 细胞，PBS 洗涤 3 次，700mL/L 冰乙醇室温固定 20min。再
6、行 PBS 洗涤 3 次，加入 1mL PIsoulution(由 1g/L Triton, 2mg DNase-free RnaseA，1g/L PI200L 组成)，室温放置 15min，混匀，过滤， 4，避光放置30min，用流式细胞仪 FACStar 检测细胞增生指数，每组 3 例。计算出 S+G2/M 期细胞所占细胞总数(G0/G1+S+ G2/M) 的百分比，即细胞增生程度。1.2.2 RT-PCR 检测 收集 RPE 细胞，并将细胞数调至1106/L，加入 1mL Trizol，室温作用 5min 充分裂解，12 000r/min，10min 离心后，28弃沉淀，加入( 含 20
7、0L 氯仿)1mL Trizol 振荡混匀，室温静置 15min，12 000r/min，15min ，4离心，吸取水相层至另一离心管，加入(含 0.5mL 异丙醇)1mL Trizol 振荡混匀，室温静置 10min， 12 000r/min，10min，4离心，弃上清，RNA 沉于瓶底，Trizol 1mL 中加入 750mL/L 乙醇，振荡摇匀，8 000r/min，5min，4离心，弃上清，室温晾干 510min ，50L 去离子水(DEPC 处理)，溶解样品，5560，510min ，测 A 值定量。按照 Invitrogen RT-PCR 试剂盒步骤进行 RT-PCR。PI3K 引
8、物：上游：5-ACT TTGTGACCTTCGGCTTT-3，下游： 5-TACATTCCTGATCTTCCTCG-3;-actin:上游：5-GTTTGAGACCTTCAACACC-3，下游：5-GT GGCCATCT CCTGCTCGAAGTC-3，引物扩增片段 400bp。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Western-blot 检测 收集细胞，PBS 洗涤 2 次，裂解细胞收集蛋白上清液，加入 2加样缓冲液，煮沸 5min。每个样品取40g 蛋白，进行 120g/L SDS-PAGE 电泳后，于 180 mA 稳压状态下 PVDF 膜转印 5h，以 20g/L 脱脂奶粉 4封
9、闭 1h 后，行 Western-blot 印迹，一抗为兔抗人 PI3Kp110 单抗(11 000)4过夜。含有1g/L Tween 的 PBS 洗涤 3 次，每次 5min。二抗为羊抗兔的辣根过氧化物标记的生物素化抗体(15 000)室温作用 1h，同上洗涤后，加入增强化学发光试剂，暗室中用高敏感 X 光胶片曝光显影。-actin 作为内参照(1500)重复上述步骤。统计学处理：实验重复 3 次。利用 SPSS 11.5 统计分析软件，采用配对 t 检验比较各组之间细胞增生程度的差别。2 结果2.1 细胞增生指数 CoCl2 建立 RPE 细胞缺氧后 8，12 和24h，处于 S 期的 R
10、PE 细胞随着缺氧时间延长而增多，各时间点RPE 细胞的增生指数均较基础状态(0h)明显升高(P0.05)。LY294002阻断剂处理组较对照组 RPE 细胞增生指数明显降低(P0.05，表 1)。2.2 PI3K mRNA 表达 半定量 RT-PCR 检测结果表明，CoCl2 缺氧前后培养的 RPE 细胞均有 400bp 目的条带 PI3K mRNA的表达。而随缺氧时间的延长，目的基因表达强度逐渐增强(图 1)。2.3 PI3K 蛋白表达 CoCl2 建立 RPE 细胞缺氧即刻(0h)，可见 RPE 细胞有少量磷酸化 PI3K 蛋白表达，说明人 RPE 细胞在基础情况下即有内源性的磷酸化 P
11、I3K 蛋白的表达。加入 200mol/L KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 缺氧刺激后，磷酸化 PI3K 蛋白表达逐渐增强( 图 2)。1：对照组;2：缺氧 1h;3：缺氧 4h;4：缺氧 8h;5：缺氧12h;6：缺氧 24h。a:PI3K;b：引物二聚体图 1 缺氧不同时间内 RPE 细胞磷酸化 PI3K mRNA 表达1：对照组;2：缺氧 1h;3：缺氧 8h; 4：缺氧 12h;5：缺氧24h图 2 缺氧后 RPE 细胞磷酸化 PI3K 蛋白表达3 讨论临床上许多视网膜脉络膜疾病的发生都与缺血缺氧密切相关。脉络膜局部长期缺血缺氧是 AMD 眼内 CNV 发生的主要原因之一7,
12、8 。CNV 生成的机制尚未完全阐明，但 RPE 细胞和 Bruch 膜的损伤是诱发 CNV 的重要原因， Bruch 膜及其周围基质的变化，改变了 RPE 细胞的基因表达，导致 CNV 发展9。在缺氧状态下，RPE细胞的多种氧反应基因上调表达，主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子(TGF) 。实验性CNV 中，RPE 也可以产生 VEGF、血管生成素(angiopoietin, Ang)和血管内皮受体 Tie 1 和 Tie210，通过自分泌和旁分泌作用于 RPE使其增生11,12 ，进一步促进 CNV 的发展。由此可见，在 CNV 的过程中 RP
13、E 细胞起着重要的调控作用，生长调节失衡是其中心环节，调节细胞生长平衡的改变，是一系列酶促反应的过程，又是调节以上各因子平衡的最后通路。PI3K 是一种重要的细胞内蛋白激酶,当细胞受生长因子等刺KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PI3K 活化，使其转化为 3，4，5— 三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)13，并与其下游分子 Akt 结合，活化的PI3K/Akt 可能通过 TSC1/2 复合物进一步激活其中下游分子 Mtor14、eIF-4E 结合蛋白 1(4E-BP1)和核糖体蛋白 P70S6K15，启动蛋白质的翻译16,17 ，因此磷酸化的 PI3K 被认为是蛋白质合成的主要信
14、号调节通路，参与细胞增生、分化、移行等的调节18。PI3K 可通过Akt、mTOR 将有丝分裂信号传递给 P70S6K，使细胞周期主要蛋白，如细胞周期素(cyclin)的翻译上调，促进 G1 期进展，使细胞周期加速19 。在卵巢癌及前列腺癌中均发现，抑制 PI3K 活性可以降低cyclinD1、细胞周期依赖性蛋白激酶 4(CDK4)的表达及 Rb 的磷酸化，导致细胞 G1 期阻滞，抑制细胞周期进展19,20。进一步证实 PI3K信号通路在细胞增生与分化中发挥重要作用。我们研究发现，利用 CoCl2 建立 RPE 细胞缺氧模型 8，12和 24h 后，RPE 细胞进入 S 和 G2/M 比例随缺
15、氧时间延长而增加(P0.01)，说明 CoCl2 模拟的缺氧环境可以使 RPE 细胞周期加速，促进增生。RT-PCR 和 Western-blot 结果提示，磷酸化 PI3K 在正常的 RPE 细胞中仅有微弱的表达，随着 RPE 细胞缺氧时间的延长，其表达水平逐渐升高。表明磷酸化 PI3K 表达与 RPE 细胞增生同步。这一结果与 Zhou 等21研究发现一致，即 PI3K 的磷酸化水平从正常乳腺上皮组织、不典型增生到肿瘤浸润渐次增加，PI3K 的表达与增生呈正相关相，提示 PI3K 可能参与了 RPE 细胞增生的调节。LY294002 因其具有较强的稳定性22，已经作为 PI3K 特KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 处理 RPE 细胞后，FCS 分析发现细胞增生受到了明显的抑制。进一步的细胞周期分析发现，抑制 PI3K 的状态下， S 期细胞数量和增生指数在各时间点较对照组明显降低，进一步表明 PI3K 可能在缺氧诱导的 RPE 细胞增生中发挥着重要作用。致谢：本研究得到德国洪堡基金会(Alexander von Humboldt Foudation)仪器设备捐赠基金 (V-8151/02085)资助，特
