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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生物细胞实验心得细胞生物学研究方法METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49从整个生命科学的发展趋势看细胞生物学研究分子水平细胞水平结构功能细胞生命活动分析综合整个生命科学的发展最终是要解释生命的活动规律，而生命的活动规律要到细胞中去寻找。而要了解细胞的活动规律，我们要在分子水平细胞内各种生物分子的代谢规律，这就需要研究细胞内的各种组分另外我们还要了解细胞的结构和功能，2由于课时所限，我们不可能所有的方法都详细讲解。3Mainpoint第一节显微技术(细胞的形态学观
2、察技术）一、光学显微镜二、电子显微镜三、显微操作技术第二节细胞分离技术第三节生物化学与分子生物学技术第四节细胞培养与细胞杂交本章重点：1.掌握细胞形态结构的观察方法；2.掌握细胞培养、细胞工程的基本技术；3.了解细胞组分的分析方法。第一节显微技术工具是人类器官的延伸。显微镜300多年的改进是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。在器具上，包括选择投射于物体上的波束的性质及为便于观察而不断改善操纵装置；在观察对象上，则是如何突显待观察的部分。波束有光波和电磁波，光学显微镜：以可见光为光源。电子显微镜：以电子束为光源。第一节显微技术、光学显微镜(TheLightMicro
3、scopy)普通光学显微镜骆驼刺根尖染色体对二氯苯饱和溶液处理9光学显微镜是如何作到这一点的?普通光学显微镜可变光阑目镜2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。放大率:最终成像的大小与原物体大小的比值;分辨率/力：分辨或区分两质点间最小距离。普通光学显微镜3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。D=/Nsin其中为入射光线波长；N=介质折射率；Nsin镜口率(低倍镜，高倍镜，油镜2=镜口角(样品对物镜镜口的张角);通常2最大值可达140度，空气N1，D约。油镜N，此时分辨率D可达，思考：如何提高显微镜的分辨能力？12表一、几种介质的折射率相差显微镜Figure3-2.Interfer
4、encebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.A+/B+相位板在物镜中加了涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种：+相板：将直射光推迟1/4，两组光波
5、合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差。+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差，结构比周围介质更加变暗。相差显微镜基本原理：利用光的衍射和干涉现象，把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高各种结构间的对比度，明者更明，暗者更暗，立体感增强，使各种结构变得清晰可见。故样品不需染色，适合观察活细胞。相差显微镜与普通光学显微镜相比有两个特殊之处：相位板环形光阑微分干涉差显微镜原理：利用两组平面偏振光的干涉。光线经棱镜折射后分成两束，分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束
6、的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。20平面偏振光光是一种电磁波,光振动的方向与它前进的方向垂直。基础知识样品经过微分干涉差显微镜,厚度上的微小差异就转化成明暗区别，增加反差，加强影像的明暗效果。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。用途：微分干涉差显微镜用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)(A)普通明视场显微镜下的纤维原细胞(B)相差显微镜下的纤维原细胞,(C)微分干涉显微镜下的纤维原细胞(D)普通暗视场显微镜下的纤维原细胞.23微分干涉差显微镜原生动物阿米巴变形虫的显微照片。进行
7、人工上色的三维图像展示了丰富的细节。细胞中有些物质，如叶绿体等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜不仅对这类物质可进行定性、定量和定位研究，还可观察其形状及在细胞内的变化。荧光显微镜FluorescencemicroscopeFluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen微管呈绿色、微丝红色、核蓝色还可进行免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。图像清晰，色彩逼真。荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：1.光
8、源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；2.有两个特殊的滤光片；3.照明方式通常为落射式。27荧光显微镜是在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。免疫荧光技术荧光素直接标记技术GFP基因与某种蛋白基因融合，可直接观察该蛋白的动态变化。28第一套滤光片为激发光滤片，装在光源和样品之间，只有能激发荧光染料发光的特定波长才能通过。第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。这样，在黑暗背景衬托下，很容易观测到发出荧光的样品。beam-splittingmirror：倾斜的、透明的镜子，使光垂直地反射到观察者的眼中。Figure3-8.Fluorescentd
9、yes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.荧光素罗丹明激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM原理：一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。系统经一次调焦，扫描限制在样品
10、的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些分层图像再由计算机重构成三维图像。LCSM的原理：物镜成像透镜共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。样品制备无特殊要求；各种染色、非染色、荧光标记的组织、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。激光共聚焦扫描显微境特点与用途：特点：用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途：亚细胞定位及动态变化。能扫描不同层次，重构出样品的三维结构。可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样
11、品的内部结构。爪蟾黑色素细胞LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管共聚焦显微镜由于可以自动改变观察的焦平面，因此纵向分辨率得到改善。分辨率越高，意味着可使用的点数越多，图像越细致。受精5天后的卵子，一些精细胞仍粘贴在它表面。胚胎和精细胞核呈紫色，而精子的尾巴是绿色。蓝色区域是缝隙连接，它们把细胞彼此联系在一起。果蝇原肠胚表层细胞质内免疫荧光标记的微丝A.免疫荧光技术36GFP标记的鼠神经中枢干细胞移入刚出生的小老鼠的脑内，已经开始形成少突细胞和星细胞。”Figure3-3.Edgeeffects.Theinterferenceeffectsobservedathighmagnification
12、whenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.暗视野显微镜darkfieldmicroscope38光学上的丁达尔现象暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。应用：观察未经染色4200nm的活体或胶体粒子。，分辨率比普通显微镜高50倍。(a)梅毒螺旋体，暗视野。(b)团藻属和水棉属的绿藻；暗视野。(c)迂回螺菌具有束状鞭毛的一种个体很大的细菌。相差。(d
13、)肉毒梭菌，它具有近端生卵形内生孢子；相差。(e)草履虫染色后观察到的中央大核和在其边上的球形小核；相差。abcde倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒，物镜在载物台之下，照明系统在载物台之上，用于观察培养的活细胞荧光共振能量转移技术用于研究生物大分子之间的距离和相互作用。传统的蛋白质-蛋白质间相互作用的研究方法都要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。荧光共振能量转移技术技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。荧光共振能量转移技术4
14、3荧光共振能量转移技术以GFP的两个突变体CFP、YFP为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时(10nm范围内)，用CFP的吸光激发，其发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。荧光共振能量转移技术就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近时，将光子能从一个受激发的荧光团转移到另一个荧光团。CFP受光激发后便发射光CFP受光激发后但没有发射光。CFP离YFP的距离大于10nmCFP与YFP非常接近YFP没有受到激发，因此也不发射光YFP没有受光激发，但发射光45两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。bCFP(转载于:写论文网:生物细胞实验心得)YFPCFP细胞自主
