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1、第五章 中药制剂中各类化学成分分析,各类化学成分的理化性质 各类成分供试液的提取纯化制备方法 各类成分定性鉴别的原理方法 各类成分定量测定的原理和方法,第一节 生物碱alkaloid类成分分析,了解生物碱的理化性质 熟悉中药制剂内Alk定性鉴别的原理方法 掌握Alk的供试液的提取纯化制备方法、定量测定的原理和方法,一、概述（了解）,生物碱是中药中重要的有效成分之一。 多具复杂的环状结构，有显著的生理作用。 至少有豆科、防已科、毛茛科、夹竹桃科、茄科、石蒜科50多科，120属以上植物中有生物碱存在。 以双子叶植物最多，其次单子叶植物，裸子植物。 以罂粟科等的植物分布较多。 生物碱的种类很多(见表
2、1)，但具生理活性大多集中在异喹啉、吲哚、茛菪烷类等衍生物。多以盐的形式存在于植物体内。,生物碱类型及其基本结构,生物碱类型及其基本结构,生物碱类型及其基本结构,a b c d e f,g I j K,与中药化学差别,(1)用量不同：分析一般样品量小。 (2)提取的原则不同：分析是保证待测组分的最大回收。 (3)分离目的不同：分析是尽量排除干扰，净化待测组分。 (4)定性目的不同,二、理化性质与提取分离,1、物理性质 一般无色结晶固体，少数为非结晶形粉未，少数有色。 2、旋光性 多具手性碳原子，所以多具有旋光性，且多为左旋。,二、理化性质与提取分离,3、酸碱性：分子中含N原子，多具有碱性。 碱
3、性： 胍季铵碱烷胺类(脂叔胺碱)吡啶(芳叔胺碱)酰胺类。 Sp3Sp2Sp1,4、溶解性 游离生物碱：极性较小，不溶或难溶于水 能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醚等有机溶媒中 分析中常用氯仿、乙醚作为提取溶剂 生物碱的盐类：大多易溶于水及醇 不溶于或难溶于苯、氯仿、乙醇等 该性质是相反的，可用来提取、分离、精制生物碱 但需注意：季胺碱、酰胺碱、和一些含极性基团较多的Alk则能溶于水 含酚羟基、和羧基的生物碱呈酸碱两性反应,二、理化性质与提取分离,二、理化性质与提取分离,5、沉淀反应 Alk在H水液或H稀醇(50）中，与Alk试剂生成难溶性 精制协助鉴定 但蛋白质、肽类、鞣质、嘌呤类，有的黄酮、香豆素
4、及查耳酮也可与某些Alk试剂反应，实验中需排除这些干扰。 含Alk样品液纯化精制后，再进行实验。,二、理化性质与提取分离,OH,水洗,H 酸性水液 Alk沉淀试剂(3种),生物碱沉淀沉淀试剂大体可分为三类 (1)与Alk生成不溶性盐类如：磷钼酸、硅钨酸(Alkertrand)、磷钨酸； (2)与Alk形成疏松的络盐如：碘碘化钾试剂(Wagner)； (3)与Alk的氮原子反应，生成不溶性加成物如：碘化铋钾(Dragendorff)、碘化汞钾试剂(Mayer)。,二、理化性质与提取分离,6、显色反应 有些Alk与某些试剂呈颜色反应，可借以识别Alk，但易杂质干扰，需净化后进行。 7、生物碱供试液
5、的提取 主根据Alk的溶解度而定。 (1)有机溶剂提取 氨水湿润Alk游离，后用CHCl3、(CH3CH2)2O提取 较稳定的生物碱盐类，可用碱性较强的NaCO3、Ca(OH)、NaOH碱化 本法缺点是不能提出水溶性生物碱,二、理化性质与提取分离,(2)醇水溶媒提取 用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水(如：0.11%)盐酸、硫酸、酒石酸等提取。 此法较简便，但提取出的杂质较多，需进一步纯化处理。 (3)混合溶媒提取 用不同极性的溶剂按不同比列混合，该法可以较好地提取出待测组分。 如：百部、粉防已用乙醚:氯仿:乙醇:10%NH3OH(25：8：25：1)。,二、理化性质与提取分离,二、理化性
6、质与提取分离,(4) 水溶性Alk：可用Alk沉淀试剂如雷氏盐(硫氰化铬铵)、磷钨酸等生成不溶性的复盐而从水中析出,沉淀溶于丙酮，通过阳离子交换树脂，氢氧化铵洗脱，可得游离生物碱 (5)生物碱样品的提取方法 常用的有：冷浸法、渗漉法、超声提取法、索氏提取法、热回流提取法等 冷浸法与冷浸超声提取法操作简便、快捷，常用 必要时，要对上述方法作比较，以优选出最佳提取方法。,8、生物碱样品预处理精制 (1)萃取法 酸碱萃取法经典法 Alk离子对萃取法，依据离子对萃取原理 生物碱在弱酸性介质阳离子+大分子(离子对试剂) 复盐（水溶性小，溶于有机溶剂） 与水溶性杂质分离 若离子对试剂为有机染料，则该法还可
7、用于生物碱的定量分析，如：小蘖碱可加入pH8.5的四溴酚酞乙酯缓冲液，CH2Cl2萃取，取CH2Cl2液比色测定。 (2)色谱法柱色谱、色谱小柱,二、理化性质与提取分离,三、定性鉴别,（一）一般理化鉴别 常用鉴别有：Alk的沉淀反应、特殊显色反应、色谱鉴别等 l、Alk的沉淀反应 三种以上试剂呈阳性反应。注意干扰 2、特殊显色反应 (1)对二甲氨基苯甲醛试剂吲哚类显蓝 (2)小蘖碱盐酸过氧化氢试剂，呈红紫 (3)Vitali醇制KOH试剂，莨菪烷类呈紫 (4)Labat反应次亚甲二氧基反应 (5)双缩脲反应麻黄碱呈紫色,（二）色谱鉴别,方法：TLC、PC、HPLC、GC等。多用TLC法。,早期
8、常用的有：酸碱滴定法、沉淀法、酸性染料比色法、雷氏盐比色法等 现用：分光光度法、TLC、HPLC、GC等 （一）总生物碱含量测定 1、经典化学法(重量法、容量法) (1)重量法 原理：Alk可与生物碱沉淀试剂定量反应生成沉淀，根据沉淀量可间接求出生物碱含量。此法操作较繁，费时、且准确度较差,四、含量测定方法,四、含量测定方法,适用范围： 凡碱性很弱多不宜用容量法或其他方法测定者 挥发性生物碱不宜用此法 例 苦参总碱测定：硅钨酸沉淀法 苦参片20%NaOH碱化氯仿回流提取稀盐酸溶解定容10%硅钨酸沉淀 过滤沉淀沉淀干燥称重，计算含量,(2)容量法 分类：酸碱滴定、两相滴定、络合滴定、沉淀容量法等
9、 I、酸碱滴定原理 生物碱呈碱性，可用酸滴定；pH指示剂指示终点。 生物碱盐，一般呈酸性(强酸弱碱盐)，可用强碱滴定。 因其终点在70-90%乙醇中比在水中明显，故可用标准碱的醇溶液滴定，以酚酞为指示剂指示终点,四、含量测定方法,四、含量测定方法,II、两相滴定原理,离子 离子 分子 在水相与水不相溶的有机溶剂(氯仿应用最多)两相中进行滴定 注意选择：合适的PH，合适的酸性染料，合适的有机溶剂，以PH最为重要。,四、含量测定方法,a、两相酸碱滴定法： 生物碱盐溶于水，加适量氯仿等有机溶剂，NaOH滴定，酚酞指示剂指示终点。滴定产生游离生物碱转溶有机溶剂，所以灵敏度比一般酸碱滴定好，又称为两相置
10、换滴定 b、两相酸性染料滴定法： 用酸性染料为滴定剂，在水与氯仿两相中滴定生物碱，Alk阳离子与酸性染料阴离子缔合进入氯仿（等有机溶剂），终点时，稍过量酸性染料使水层产生颜色指示终点。利用氯仿层可比色定量。,四、含量测定方法,III、络合滴定原理 用过量的重金属生物碱沉淀试剂，使生物碱沉淀，将沉淀溶解，然后用络合剂滴定沉淀中重金属 先用过量重金属生物碱沉淀试剂，使生物碱沉淀，后用络合剂滴定溶液中剩余的过量重金属生物碱沉淀试剂，而间接定量。繁琐少用 、沉淀容量法 利用生物碱与生物碱沉淀试剂的反应，直接或间接定量,2、光谱法定量,（1）直接测定 （2）比色法（可见分光光度法） 酸性染料比色法、雷氏
11、盐比色法、苦味酸比色法,I 、酸性染料比色法 原理：与酸性染料滴定法相同 本法关键：pH值、酸性染料种类、有机溶剂 常用染料：甲基橙、溴麝香草酚蓝BTB、溴甲酚绿、溴酚蓝、溴甲酚紫等 有机溶剂选择：依据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱 常用有机溶剂：氯仿、二氯甲烷 注意：微量水份可使有机相混浊，影响比色，应先脱水后测定,（2）比色法（可见分光光度法）,II 、雷氏盐比色法 原理：Alk与雷氏盐生成红色沉淀，此沉淀溶于丙酮，于520-526nm波长处，选择最大吸收波长，测定吸收度。根据雷氏盐丙酮液的为106.5(单盐)或203.0(双盐)。按下式计算样品生成雷氏盐重量（W，g）。
12、,（2）比色法（可见分光光度法）,IV、其它比色法 苦味酸比色法 方法：沉淀加碱解离，以有机溶剂提出生物碱，将苦味酸的碱性水溶液进行比色 氯仿提取苦味酸生物碱盐，碱性缓冲液使盐解离，并将苦味酸提取而进行比色 氯仿提取苦味酸盐而直接进行比色。,（2）比色法（可见分光光度法）,、异羟肟酸铁比色法 酯键结构碱性加热水解羧基+羟胺异羟肟酸+Fe3+异羟肟酸铁（紫红色化合物） 如：乌头总生物碱的测定,主要有HPLC、GC、TLC等 1、TLC法 对样品纯化程度要求不高。但一般点样误差大，定量时，首先作一标准曲线，考察线性范围，确定定量方法(内标/外标、一点法/二点法)，均需同板标准品随行对照。同时要考察
13、方法的稳定性、同板与异板的精密度,（二）单体生物碱的含量测定,2、HPLC法,生物碱盐为离子型化合物.有离子交换、离子对、正相HPLC法。 生物碱为分子型化合物，可用反相、分配HPLC法，应用较多。 注意：在Alk分析中，反相柱硅胶表面仍残留有游离的硅醇羟基，呈弱酸性，会吸附碱性的生物碱使色谱峰拖尾 克服措施： I、固定相 通常硅醇羟基被覆盖率越高，分离效果越好。如用C8比C18好。,2、HPLC法,II、流动相 为减小ALK在反相柱上的拖尾，可采取如下措施： a、加入有机胺类： 常加入三乙胺或季胺碱盐。 使流动相呈碱性，抑制或掩蔽游离硅醇羟基影响。 b、在流动相中加入离子对试剂： 与ALK类
14、成分生成离子对掩蔽其碱性基使之不能与固定相表面的硅醇基作用，使ALK类成分易于出峰，且峰形好。,c、增加流动相的脂溶性 d、调整流动相的pH值 III、柱温 升高柱温 、样品液的制备 是定量分析工作是否成功的关键 两大类：溶剂萃取法、色谱分离法,2、HPLC法,3、 GC法： 适于有挥发性，遇热不分解的生物碱类 如麻黄碱、苦参碱和颠茄类生物碱 例：洁尔阴洗剂中苦参碱的测定 4、其他测定方法,（二）单体生物碱的含量测定,五、应用实例,1、含小檗碱的中药制剂分析 (1) 万氏牛黄清心丸 TLC法鉴别盐酸小檗碱 UV法/一阶导数光谱法测定盐酸小檗碱 (2) 安宫牛黄丸 HPLC法测定盐酸小檗碱 (3
15、) 香连丸 HPLC法,五、应用实例,2、含麻黄碱的中药制剂分析 麻黄碱性质： 挥发性 碱性较强 可与大多数生物碱沉淀试剂发生反应 可与金属离子Cu2+、Ni2+、Co2+在CS2碱性条件形成棕或黄色沉淀，溶解在苯-丙酮（1：1）溶液中定性鉴别含量测定。,五、应用实例,实例： 1）复方川贝精片 化学和薄层色谱鉴别 2）疏风定痛丸 TLC法鉴别 GC法测定含量 3）止咳化痰丸 HPLC法测定含量 4）小儿止咳糖浆 UV比色法测定含量,五、应用实例,3、含延胡索乙素的中药制剂分析 1）安胃片 UV比色法鉴别 UV比色法测定含量 2）肠胃宁片 TLCS法测定含量 3）沉香舒气丸 TLCS法测定含量,五、应用实例,4、含乌头碱的中药制剂分析 1）酸碱滴定/二阶导数光谱法测定小活络丸中乌头碱 乌头15g研细无水乙醇过夜提取浓缩加2%盐酸20ml乙醚萃取酸液乙醚：氯仿(3:1)提取3次低温蒸干混合溶液再蒸干无水乙醇5ml溶解 2）HPLC法测定蒙药那如-3丸中乌头碱、中乌头碱、次乌头碱,五、应用实例,3）酸性染料比色法：参附注射液中乌头总碱 改良异羟肟酸铁比色法： 参附注射液10ml加0.1mol/L HCl 20ml乙醚萃取5次？酸水pH9-10乙醚萃取5次？合并无水硫酸钠过滤？乙醚洗二次？合并醚液除溶剂？无水乙醇定容至10ml。,
