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1、,植物激素的酶连免疫分析法,DNM-9602G酶标分析仪,DNM-9602 标配酶标分析仪,DNM-9602A酶标分析仪,几种酶标分析仪,操 作 步 骤,包被-温育-洗涤-竞争-温育-洗涤-加二抗-温育-洗涤-显色-比色-计算,包 被,每小孔中加入100l包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。37 下1.5小时。,洗 板,将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。,竞 争,即加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成： ABA标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀释8个浓度（包括2个0ng/ml
2、，加入前两行的最后两排 ）。将系列标准样加入96孔酶标板的1、2、3行，每个浓度加3孔，每孔50l,其余孔加待测样，每个样品重复3孔，每孔50l。,加 抗 体,在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加50l，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件37左右0.5h。,洗 板,将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。,加“二抗”,将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10l），混匀后，在酶标板每孔加100l，然后将其放入湿盒内，置37下，温育0.5h。,洗 板,将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩
3、掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。,加底物显色,在每孔中加100l 邻苯二胺（OPD）溶液（小心勿用手接触OPD），（每10ml溶液中含4l 30% H202。混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50l 2mol/L硫酸终止反应。,比 色,在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。,用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出
4、待测样品的ABA含量的对数。利用反对数求得ABA的绝对含量。,数 据 分 析,植物激素的测定方法？,生物活性法气相色谱（气-质联机）液相色谱（液-质联机）酶连免疫法（ ELISA 法）,问题：我们该选择哪种板呢？,ELISA技术的特点与局限性,（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成免疫吸附剂；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。（2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。,注意事项 ：,（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应
5、物间不能充分混匀反应。（2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全。（3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。（4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴，否则出现较大误差。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),原理（以间接性ELISA为例）：,显色,抗 原,医学上重要的抗原,抗原的概述,抗原（Ag）是指能与淋巴细胞抗原受体特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内、外发生特异性反应的物质抗原的两个基本特性免疫原性（immunogenicity)免疫反应性 (immunore
6、activity),完全抗原 (complete antigen)半抗原(hapten)载体(carrier),抗体（Ab）,抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白,一、基本概念：,二、免疫球蛋白的分子结构,免疫球蛋白的基本结构,四肽链结构 ，链间二硫键连接两条重链（H）和两条轻链（L）氨基端和羧基端。,根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C）可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺
7、序变化较大恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及 含糖量都比较稳定,可变区与恒定区,单克隆和多克隆抗体的比较和用途,特异性,敏感性,均一性,McAb,PcAb,低,差,无,高,强,有,1、用于免疫学检测，辅助临床诊断,2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原,3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等,4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。,多克隆抗体：多个抗原决定基机体多种抗体的混合物单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞克隆产生的、针对某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体基因工程抗体,六、人工制备的抗体,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光）,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）,间接ELISA,双抗夹心法,酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法）,
