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1、单克隆抗体技术,讲授提纲,多克隆抗体的概念 单克隆抗体的概念 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的应用,1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。,多克隆抗体 (Polyclonal antibody),给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,
2、它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体。 抗原决定簇：是指抗原分子中决定抗原特异性的特 殊化学基团，又称表位(epitope)。,单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）,通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团。,B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将
3、这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,单克隆抗体制备原理,用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基对融合细胞进行培养和筛选。 HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。,单克
4、隆抗体制备原理,-,-,-,-,-,HAT培养基的选择原理, 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。 B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活57d，且功能下降)。 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。,在HAT选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合
5、成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。,HAT选择培养原理,核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,单克隆抗体杂交瘤技术基本流程,单克隆抗体的制备步骤,1. 免疫原的制备 颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等 分子量大于5000Da生物物质。 可溶性抗原：多糖、药物、
6、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。 可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。,2. 免疫动物,可溶性抗原（蛋白质） 以1mg/ml5mgml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml0.6ml，间隔周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。 颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以浓度每只皮下注射.ml，每周次，共免疫次，取
7、脾前天，再免疫一次即可。,为什么要反复注射抗原？,正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.01075.0107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。,3. 骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态，本身不 能分泌任何抗体或免疫球蛋白； 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同 一品系，以便两者组织相容性抗原一致； 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。,4. 细胞融合,取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5
8、-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG作为融合剂，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器皿中培养。,在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程
9、中必须使用饲养细胞。,许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。,细胞融合方式,物理融合法： 电融合、激光融合 化学融合法 ：PEG融合 生物融合法 ：仙台病毒,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HA
10、T培养液悬浮细胞，置于培养孔内,5. 杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。,6.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆,经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。 克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。,阳性孔的检测,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,7. 单克隆抗体的制取,制取方式： 体外培养罐法
11、体内腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定是否针对同一决定簇,体内腹腔接种,克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上
12、清液的1001 000倍。,杂交瘤细胞的冻存,当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。,杂交瘤细胞通常用含有8-10%的二甲亚砜和20小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。,单克隆抗体的特性, 单一特异性，与一个抗原决定簇反应； 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； 一经制出
13、，可无限量地供应； 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原； 能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。,多抗与单抗制剂的比较,多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （培养上清） 特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025 无关Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + + 特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇 稳定性 较好 略差 略差 重复性 差 好 好,四、单克隆抗体靶向技术与靶向单抗应用,单克隆抗体靶向制剂利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作用的制剂。 制备方法： 与药物直接连接 McAb 小分子 药物 大分子 药物,应用： 特异性溶解血栓药物 抗肿瘤药物 其它药物,思考题,1、比较多克隆抗体与单克隆抗体的特点 并考虑其在应用上的差异 2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要 技术步骤有哪些？,
