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1、线粒体功能及其检测,线 粒 体 结 构,线粒体是真核细胞的一种细胞器，包括四个功能区隔 :外膜、内膜、膜间隙和基质。 主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占65-70%，脂类占25-30%。,外膜 (out membrane),膜孔蛋白（porin）、离子通道蛋白以及Bcl-2 家族蛋白。 由膜孔蛋白构成的亲水通道，允许分子量为5KD以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。,内膜 （inner membrane）,电子传递链(呼吸链)复合物IIV 和复合物V(ATP 合成酶)。 通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统。,膜间隙(interme
2、mbrane space),细胞色素C 电压依赖性阴离子通道(VDAC)、ADP/ATP转换蛋白。 线粒体膜转运孔道(mitochondrial permeable transition pore，MPTP)存在于内外膜接触点。 凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)和Procaspase 2、3、9 及其他酶蛋白。,基质（matrix）,三羧酸循环：除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中。 线粒体基因组：基质具有一套完整的转录和翻译体系。包括线粒体DNA（mtDNA），70S型核糖
3、体，tRNAs 、rRNA、DNA聚合酶等。 存储钙离子的致密颗粒。,mtDNA,环状，编码2 种rRNA、22 种tRNA和13 种参与呼吸链形成的多肽。 通常裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和完善的自我修复系统，又靠近内膜呼吸链，极易受环境影响，突变频率比nDNA 高1020 倍。 如果线粒体DNA发生突变，不能产生足够ATP而导致细胞功能减退甚至死亡，临床上表现复杂多样，即线粒体病。 母系遗传。,线粒体功能,能量供应 氧化应激 凋亡 钙储池 细胞周期、信号转导 肿瘤 发育等,线粒体与能量供应,细胞有氧呼吸和供能的场所，供应细胞生命活动95%的能量。 线粒体的主要功能是把氧化各种底物产生
4、的自由能转化为可被细胞直接利用的形式ATP。 线粒体具有能量代谢与自由基代谢两条途径。,燃料分解（胞质中）,乙酰CoA生成,三羧酸循环(线粒体基质),电子传递和氧化磷酸化(内膜上),生成ATP,葡萄糖 脂肪酸 氨基酸,线粒体与氧化应激,线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位，消耗氧用于合成ATP的同时不可避免地产生活性氧。 氧化应激作用下，膜转运孔道开放造成线粒体基质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，呼吸链脱偶联，能量产生中断。 还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂，通透性增高，释放出包括细胞色素C在内的各种活性蛋白。,过多自由基的产生可导致mtDNA的损伤，氧化损伤是mtDN
5、A突变的主要原因。 线粒体本身也极易受氧化应激的攻击。,活性氧在启动和调节细胞凋亡的过程中扮演着重要的角色。 活性氧的积累可以导致： 线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生； 细胞色素C从内膜脱落并进入到胞质中； BAX表达，caspase活化等。这些都是启动细胞凋亡的因素。,线粒体与凋亡,从线粒体释放的细胞色素C与凋亡诱导因子、Procaspase 9结合在一起形成“凋亡体”（Apoptosome），导致Caspase 9和Caspase 3的激活。 内膜Bcl-2 家族蛋白调控紊乱。 Caspases激活、胞浆Ca+水平升高、产生神经酰胺，直接或间接地引发膜转运孔道持续开放。,ROS膜转运
6、孔道持续开放凋亡,钙储池,线粒体感受到钙微区，通过膜上协同转运体将钙摄入基质，然后以磷酸钙的形式储存在一些较大的致密颗粒中。 积累的Ca2+ 又可以通过钠钙交换系统和膜转运孔道再次释放到胞质，从而调节胞浆中钙离子的动态平衡，影响细胞内许多相关的生理活动，如信号传导、能量代谢和细胞凋亡。 Ca2+能结合线粒体膜转运孔道上的金属结合位点，开放膜转运孔道，从而诱导渗透压的改变、ATP的耗竭和线粒体的皱缩，细胞色素 C释放，活化 Caspase 9和Caspase 3，诱发细胞凋亡。,线粒体功能紊乱,线粒体病（primary genetic defects）线粒体病理性损伤,线粒体病,mtDNA突变(
7、点突变、缺失、插入）导致线粒体功能缺陷。如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病、老年性痴呆、帕金森病、糖尿病等。 mtDNA突变随着年龄累积。,mtDNA突变 呼吸链复合体IIV活性下降 ATP合成减少 氧自由基产生增多 钙稳态失衡 脂质氧化增强,线粒体功能变化,线粒体病理性损伤,II型糖尿病,胰岛细胞线粒体参与胰岛素分泌、胰岛素抵抗的形成。 线粒体是高血糖时细胞ROS的重要来源。 线粒体氧自由基增多与糖尿病微血管并发症的发病机制相关。 线粒体本身受氧化应激攻击，导致mtDNA 合成减少、发生突变。,glucose-induced ROS initiates mesangial cells apop
8、tosis glucose-induced ROS initiates podocyte apoptosis and depletion glucose-induced ROS initiates endothelial cell apoptosis glucose-induced ROS initiates tubular cells apoptosis,糖尿病肾病,High glucosemitochondrial ROSkidney cells apoptosis,Nitrotyrosine level(硝基酪氨酸, marker of oxidative stress) complex
9、 I and complex V ATP/ADP ratio Uncoupling protein-2 (UCP-2) expression membrane potential,M. Anello et al. Functional and morphological alterations of mitochondria in pancreatic beta cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia, (2005) 48: 282289,7 cases, clinical diabetes was 5.60.6 years 胰岛组织
10、:,8-羟基脱氧鸟嘌呤 (8-OHdG，kidney and urine) Mitochondrial DNA Deletion COX I/COX IV(mt DNA/nDNA),Maiko Kakimoto, Toyoshi Inoguchi, Toshiyo Sonta. Accumulation of 8-Hydroxy-2-Deoxyguanosine and Mitochondrial DNA Deletion in Kidney of Diabetic Rats. Diabetes 51:15881595, 2002,STZ rats, 观察时间：4，8周 肾组织:,NADH d
11、ehydrogenase(complex I) cytochrome-c oxidase (complex IV) COX I mtDNA levels mtDNA deletion,Dirk Lebrecht1, Bernhard Setzer1, Rolf Rohrbach, et al. Mitochondrial DNA and its respiratory chain products are defective in doxorubicin nephrosis. Nephrol Dial Transplant, 2004, 19: 329336,doxorubicin nephr
12、osis rats 肾组织：,ATP 膜转运通道开放程度 cytochrome c caspase 3 Ca+,Peraza MA, et al.Morphological and functional alterations in human proximal tubular cell line induced by low level inorganic arsenic: evidence for targeting of mitochondria and initiated apoptosis. J Appl Toxicol. 2006, 26(4):356-67,体外培养肾小管上皮细胞
13、,线粒体功能检测,enzyme activity assays(分光光度法)NADH (complex I), succinate dehydrogenase (complex II) 细胞色素c还原酶 (complex III) COX (complex IV) ATP （ luciferin/luciferase发光法，核磁 共振法） 呼吸控制率(ATP 合成功能，氧电极法),能量供应,氧化应激,8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG，ELISA法) ROS(分光光度法) glutathione and coenzyme Q(分光光度法, HPLC),细胞色素C含量（western blot) caspase-9 and caspase-3 (分光光度法) BCL-2(免疫组化，western blot) BAX (免疫组化，western blot) 膜转运通道开放程度(分光光度法) Ca+(分光光度法) 膜电位,凋 亡,levels of mtDNA(PCR) mtDNA deletion(PCR) COX I/COX IV(PCR，免疫组化，western blot),mtDNA,Thank you,
