《蛋白质纯化色谱技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质纯化色谱技术（92页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2018/10/28,第四讲 蛋白质纯化色谱技术,一、色谱技术概述 二、凝胶过滤色谱（GF） 三、离子交换色谱（IEX） 四、疏水色谱（HIC） 五、反相色谱（RPC） 六、亲和色谱（AC）,一、色谱技术概述,色谱法，层析法，色层法（Chromatography） 是一种 “分离检测” 的“定量定性” 分析方法 19031906 俄国科学家Tswett发明 分类：色谱分离方法很多，种类有四、五十种按大类分类法：液相色谱（Liquid Chromatography）气相色谱（Gas Chromatography）按原理分类法：按形式分类法：按工作压力分类法：,色谱技术（分配色谱）,概念：色谱技术
2、是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（分离介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,基本组成,流动相,泵,分离柱,检测器,输液,分离,检测,数据记录,进样器,进样,色谱图,输液泵,流速 压力 精度 脉冲 保养 梯度形成,进样阀,样品,采样位置,废液,流动相,接色谱柱,手动（六通阀）进样器,（）,（）,定量环,层析柱（填料/介质）,分离的关键场所 使用方法不同，先查阅说明书 注意清洗保养 防止气泡进入 样品及缓冲液的预处理 保湿,填料（层析介质）,蛋白质实验技术层析纯化,分离官能团； 基质骨架； 粒
3、径/分辨率；,层析柱,监测器,紫外监测器 电导监测器 pH值监测器 保养与寿命,收集器Fraction Collector Frac-950,Rack types,4 x 96-well plates (deep or normal) + 8 x 30 mm,120 x 18 mm + 8 x 30 mm(standard rack),240 x 12 mm,操作系统,色谱系统,层析系统（蛋白纯化设备）,AKTA prime,AKTA purifier,Existing KTA range,KTAexplorer-fast method development,KTApurifier-high
4、 performance,KTAFPLC,KTAprime,Introducing the new KTApilot,18,Downstream setup,STREAMLINE 200 column, containing 5 L of STREAMLINE rProtein A in expanded mode,100 L scale fermentor,1997-06-16,19,KTA,means real genuine true,KTAdesign - an evolving platform,1996: KTAexplorer - methods and process deve
5、lopment 1997: KTApurifier - peptide and nucleic acid purification 1998: KTAFPLC - high performance protein purification 1999: KTAprime - simple protein purification 2000: New fraction collector, sample pump and software,1997-06-16,21,KTAexplorer,Fast method and process development and scale-up for p
6、roteins, peptides and nucleic acids,Fully equipped for development tasks,Options: Autosampler Sample pump Air sensors,1997-06-16,22,KTApurifier,High performance purification and characterisation of peptides and nucleic acids,Options: Autosampler Sample pump Valves Air sensors,Optimised for high perf
7、ormance purification,1997-06-16,23,KTAFPLC,High performance purification of proteins,Reliable, well proven technology,Options: Valves Sample Pump Air sensors,1997-06-16,24,KTA prime,Reliable, well proven technology,Options: Valves Sample Pump Air sensors,色谱操作一般过程,色谱分离的基本概念,分配系数 可由Langmuir方程得出Kd-分配系数
8、 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,分配系数,蛋白质实验技术层析纯化,指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。 K 固定相溶质浓度/流动相溶质浓度 分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。,保留时间（tR）和 保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,理论塔板数,蛋白质实验技术层析纯化,number
9、of theoretical plates 色谱的柱效参数,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。,色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度理论塔板高度：L-柱长,分辨率(Resolution),蛋白质实验技术层析纯化,分离度(Rs); 表示两个洗脱位置相邻的溶质相互分离的程度。,相关视频,Tricorn柱装填； XK柱装填； 柱效检测。,凝胶过滤色谱（
10、Gel Filtration Chromatography ) 也称大小（体积、空间）排阻色谱，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。,二、凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱原理,分子量测定,脱盐,Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。 经典的凝胶介质 Sepharose系: 经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。 型号最多、应用最广 Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙稀酰胺
11、共聚而成。 经济高效 Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。 最新，选择性强，分辨率极高,常用的凝胶介质,脱盐： Sephadex G10、25 缓冲溶液交换：Sephadex G10、25 中间纯化： Sephadex G200 精纯 ：Sephacryl 、Superdex,常用的凝胶介质的应用,建议流速2039cm/h,建议流速3060cm/h,色谱条件的选择,凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越高。 流速：孔径较小较结实的填料，耐受的流速要高于孔径大的填料。 上样：上样量；样品浓度pI，但不能高于介质功能基团的pK； 阳离子交换层析：蛋
12、白质带正电荷，则要求pHpI，但不能低于介质功能基团的pK；,色谱条件,缓冲溶液： 阴离子交换层析：Tris-HCl 阳离子交换层析：PB 上样： 盐浓度 上样量：载量（吸附层析） 样品蛋白浓度不可过高（低于10mg/mL）； 须经离心或过滤处理,吸附速度： 洗脱方式：改变离子强度、pH层析聚焦（Chromatofacusing ） 等梯度洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗脱需根据出峰情况调整。,洗脱,蛋白质实验技术层析纯化,线性洗脱,梯度洗脱,梯度洗脱,离子交换剂的选择,考虑因素： 酸碱强弱：由功能基团决定 稳定性 再生性 经济,离子交换剂的选择,常见类型,纤维素类
13、：无定形，分辨率和稳定性都较低 葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影响较大； 琼脂糖系：最常用 聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的 苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast FlowBio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Sour
14、ce 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列,常见问题分析,不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高； 峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯 分辨率低：梯度太大；流速太高 前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生 峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀,四、疏水性相互作用色谱 (Hydrophobic Interaction Chromatography）,
15、Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity,“盐促吸附层析” 在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上的疏水配基产生吸附作用。,Mechanism of HIC,Na2SO4 1.0 M,疏水色谱操作,疏水色谱特点,特点：它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。 填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶等。,疏水层析VS反相色谱,同： 分离介质（固定相）吸附原理 异： 作用强弱用途,五、反相色谱,原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。 一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活； 常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。,
