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1、常用分子生物学技术的原理及应用 The popular technology in molecular biology: principle and application,第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular hybridization & blotting technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。,一、分子杂交与印迹技术的原理,杂交的原理实
2、质是核酸分子的变性与复性过程,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.,原始文献出处：,（一）印迹技术,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,琼脂糖分离的DNA片段 变性为单链 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使
3、之成为固相化分子。,载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的区带。,2. 印迹(blotting)定义,将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。,3. 应用,广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测,4. 发展,电转移印迹技术、 真空吸引转移印迹等,（二）探针技术,探针(probe)的概念,是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测核酸样品中是否存
4、在某一特定的基因。,探针的种类,寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针,将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。,探针技术的概念,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting),（二）RNA印迹技术 (Northern blotting),（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting),（一）Southern blotting,转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸
5、,纸巾,玻璃板,重物,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,基因组DNA的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。 重组质粒和噬菌体的分析。,Southert blotting用途,放射自显影照片,（二）RNA印迹技术(Northern blotting),相同点：,Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸） and hybri
6、dization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354,原始文献出处,名称相对于Southern blotting,转移的是RNA 转移前无需酶切 转移效率较高 变性方法,不同点,原理均为毛细作用。,（二）RNA印迹技术,Northern blotting 用途检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,Northern blotting 结果,由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少,（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹),首先将混合
7、蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。,与DNA和RNA印迹相似之处,蛋白质的转移只有靠电转移。 蛋白质的检测以抗体作探针。 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。,与DNA和RNA印迹不同之处,Western blotting应用,检测样品中的特异蛋白质的存在。细胞中特异蛋白质的定量分析。蛋白质分子的相互作用研究。,辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol 鲁米诺）氧
8、化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。,Western blotting应用,SDS-PAGE purified recombinant human CK2(重组人酪蛋白激酶2) subunit and its Western blotting,用已知的特异抗体检测目的基因蛋白,重组人酪蛋白激酶2,三种印迹技术的比较,斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization
9、)DNA芯片技术 (DNA chip),其他印迹技术,斑点印迹 (dot blotting),A Dot blot is a technique in molecular biology used to detect biomolecules. It represents a simplification of the northern blot, southern blot, or western blot methods. In a dot blot the biomolecules to be detected are not first separated by electrophor
10、esis. Instead, a mixture containing the molecule to be detected is applied directly on a membrane as a dot.This is then followed by detection by either nucleotide probes (for a northern blot and southern blot) or antibodies (for a western blot).,The technique offers significant savings in time, as c
11、hromatography or gel electrophoresis, and the complex blotting procedures for the gel are not required. However, it offers no information on the size of the target biomolecule. Furthermore, if two molecules of different sizes are detected, they will still appear as a single dot. Dot blots therefore
12、can only confirm the presence or absence of a biomolecule or biomolecules which can be detected by the DNA probes or the antibody.,原位杂交 (in situ hybridization),In situ hybridization (ISH) is a type of hybridization that uses a labeled complementary DNA or RNA strand (i.e., probe) to localize a speci
13、fic DNA or RNA sequence in a section of tissue, or, if the tissue is small enough, in the entire tissue. DNA ISH can be used to determine the structure of chromosomes. Fluorescent DNA ISH (FISH) can, for example, be used in medical diagnostics to assess chromosomal integrity.RNA ISH (hybridization h
14、istochemistry) is used to measure and localize mRNAs and other transcripts within tissue sections or whole mounts.,A：正常细胞，两绿两红. B：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，一绿一红两融合. D：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，两红两绿一融合，这由于异常染色体上面的BCR和ABL基因分离造成的. E：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号和一个额外的Ph 染色体。一红一绿三融合.,DNA芯片,将多种已知序列的DNA排列在
15、一定大小的固相支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类的技术。,第 二 节 PCR技术的原理与应用,（Polymerase Chain Reaction，PCR）,聚合酶链反应,PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。,PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。,The Nobel Prize in Chemistr
16、y 1993,“for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry“,Michael Smith,La Jolla, CA, USA,Kary B. Mullis,University of British Columbia Vancouver, Canada,“for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method“,“for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies“,5,Primer 1,5,Primer 2,5,
