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1、丝虫特异IgG4试剂盒 检测方法,广西丝虫病监测技术培训班 2007-09-13于富川,一、ELISA介绍,ELISA是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称，是在免疫酶技术上发展起来的一种新型免疫测定技术。属固相酶免疫测定技术。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自20世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,二、ELISA原理,抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色
2、产物。待测抗体的量与有色产物成正比。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。同理也可包被抗体，测定抗原含量。,间接法 (测定抗体)夹心法 (测定抗原)竞争法 (测定抗原),三、ELISA常用方法,间接法,A. 将抗原吸附于固相载体表面,C. 加酶标抗体,B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物,D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量。,夹心法,A. 将抗体吸附于固相表面,C. 加酶标抗体,B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物,D. 加底物。底物的降解量抗原量,竞争法,A. 将抗体吸附在固相载体表面,竞争法,B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结 合抗 体； 对照只加入酶标抗原,C. 加底物。对照孔与样品孔
3、底物降解量的差未知抗原量。,对照,样品,四、检测特异IgG4亚类抗体的优点1,机体感染丝虫后，血清中特异IgG4抗体显著升高，并且 IgG4抗体是一个短程抗体，当感染的病原体被机体清除后，IgG4抗体迅速降低或消失。因此，检测IgG4可以用于诊断和疗效考核。,四、检测特异IgG4亚类抗体的优点2,鳞酸胆碱（PC）和多糖蛋白（GAC）是多种寄生虫所共有的抗原成分，是重要的交叉反应原。IgG（ IgG1、 IgG2、 IgG3）抗体分子的可变区具有结合（PC）和（GAC）抗原决定蔟的部位，因此检测总IgG时，多种寄生虫之间常发生交叉反应。由于IgG4抗体分子可变区没有结合PC和GAC的结构，故检测
4、特异IgG4，不易出现交叉反应。,四、检测特异IgG4亚类抗体的优点3,另外，该试剂盒不仅能检测血清，还可检测滤纸血样，因此该试剂盒特别适合流行病学调查和疾病检测。,五、试剂盒的组成,丝虫抗原包被板 96T 反应终止液 10ml/瓶 抗人IgG4酶结合物 10ml/瓶 阴性对照 1支 洗涤剂干粉 2袋 阳性对照 1支 底物稀释液 12ml/瓶 使用说明书 1份 底物干粉 1支,丝虫IgG4抗体酶免检测试剂盒酶免检测试剂盒,山东省寄生虫病防治研究所和深圳市康百得生物科技有限公司联合研制,六、样本采集,血清：采受检者静脉或末梢血，离心后收集血清。在低温下运送，4保存，-20可长期保存。 滤纸血：以
5、皮肤消毒剂消毒耳垂(或指端)待干，用一次性采血针快速深刺，以洁净滤纸(约长68cm、宽2cm)沾取自然流出的一滴耳垂或手指血(约20l)，血斑直径应在1.2cm，并要求浸透滤纸，每个受检者采制滤纸血2个血膜，自然干燥后用塑料袋密封置4保存（可保存约6个月，样本可常温邮寄）。,滤纸血血膜制作示意图,6cm,直径1.2cm (复核用),2cm,编号,直径1.2cm (检测用),七、操作,（一）将每袋洗涤剂干粉用500ml蒸馏水溶解作反应板洗涤液和样品稀释液用。血清样本按1：40稀释，滤纸血样本按直径1.1cm圆片加400l样本稀释液，37浸泡2小时(或4过夜)稀释处理。 （二）取已稀释的样本100
6、l加入反应板孔内，同时设阴性、阳性对照（阴、阳性对照已稀释，直接加入100l）及空白对照（加100l样本稀释液）各1孔，37反应90分钟后甩去孔内液体，用洗涤液加满各孔，静置30秒后甩去，共洗5次，最后一次拍干。,七、操作,（三） 除空白对照孔外每孔加抗人IgG4酶结合物2滴，37反应90分钟后甩干孔内液体。同上洗涤。 （四）将底物干粉完全溶解于底物稀释液中(底物溶解后4避光可保存1周)，各孔加入底物溶液2滴，37反应30分钟后加1滴终止液终止反应，混匀，观察结果。,操作图,八、结果判断,（一）肉眼观察：当阴性对照孔无色或显微黄色，阳性对照孔呈明显黄色时，试验有效。待检样品孔颜色呈明显深于阴性
7、对照的黄色即判为阳性。 （二）仪器检测：应用酶标仪以空白对照孔调零，在波长405nm处读取各孔OD值。以样本OD阴性对照OD值的2.1倍为阳性，若阴性对照OD值不足0.07，按0.07计算。,九、注意事项,1.检测盒应置于4可保存6个月，取用时平放于实验台恢复至室温后使用。 2.底物溶解后不能长期保存应尽快用完。 3.肉眼判断结果不太鲜明，最好以酶标仪测OD值来判断结果。 4.血清样本要长期保存时须置于-20，滤纸血样本于4可保存6个月左右。 5.终止液有腐蚀性，应避免与皮肤接触。,丝虫特异性IgG4检测与病原学血检结果比较,湖南段绩辉 应用丝虫特异性IgG4检测试剂盒在湖南省消除丝虫病地区的监测研究 结果,几种不同人群丝虫病IgG4检测结果,原微丝蚴血症者滤纸干血343份，采自湖南省龙山县、桂阳县和保靖县原微丝蚴血症者滤纸干血，均转阴2023年；儿童滤纸干血542份，采自湖南省龙山县、桂阳县、保靖县和吉首市基本消灭丝虫病后5所小学612岁以下儿童滤纸干血；均在-20贮存。,感谢各位！,
