肠道病毒分离技术

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1、国家脊髓灰质炎实验室国家脊髓灰质炎实验室国家脊髓灰质炎实验室国家脊髓灰质炎实验室王东艳王东艳王东艳王东艳 2008200820082008- - - -4 4 4 4- - - -9 9 9 9肠道病毒分离技术肠道病毒分离技术肠道病毒分离技术肠道病毒分离技术用于病毒分离和鉴定标本的种类用于病毒分离和鉴定标本的种类用于病毒分离和鉴定标本的种类用于病毒分离和鉴定标本的种类用于病毒分离和鉴定标本的种类用于病毒分离和鉴定标本的种类用于HFMD病毒分离的标本包括粪便、 咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系 统症状，可以采集脑脊液标本。 用于AHC病毒分离的标本主要是结膜拭 子或结膜刮取物。用于用于HFMD

2、HFMD病毒分离的标本包括粪便、病毒分离的标本包括粪便、 咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系 统症状，可以采集脑脊液标本。统症状，可以采集脑脊液标本。 用于用于AHCAHC病毒分离的标本主要是结膜拭病毒分离的标本主要是结膜拭 子或结膜刮取物。子或结膜刮取物。1.1.粪便标本的处理粪便标本的处理1.1.1.1.粪便标本的处理粪便标本的处理粪便标本的处理粪便标本的处理A）所需试剂和耗材所需试剂和耗材： 15ml或50ml耐氯仿离心管； 1ml 或5ml吸氯仿用的玻璃吸管； 5ml和10ml吸管； 木制便签； 外螺旋盖的冻存管（5ml）； 直径大约23mm的玻璃珠；

3、 混有抗生素的完全PBS 氯仿（以乙醇作为稳定剂）。 注意注意：完全完全PBS及氯仿的作用及氯仿的作用。A A）所需试剂和耗材所需试剂和耗材：所需试剂和耗材所需试剂和耗材： 1515mlml或或5050mlml耐氯仿离心管；耐氯仿离心管； 1 1mlml 或或5 5mlml吸氯仿用的玻璃吸管；吸氯仿用的玻璃吸管； 5 5mlml和和1010mlml吸管；吸管； 木制便签；木制便签； 外螺旋盖的冻存管（外螺旋盖的冻存管（5 5mlml）；）； 直径大约直径大约2323mmmm的玻璃珠；的玻璃珠； 混有抗生素的混有抗生素的完全完全PBSPBS 氯仿氯仿（以乙醇作为稳定剂）。（以乙醇作为稳定剂）。

4、注意注意：完全完全注意注意：完全完全PBSPBS及氯仿的作用及氯仿的作用。及氯仿的作用及氯仿的作用。b)b)粪便标本处理操作步骤粪便标本处理操作步骤：生物安全柜中操作生物安全柜中操作b)b)b)b)粪便标本处理操作步骤粪便标本处理操作步骤：粪便标本处理操作步骤粪便标本处理操作步骤：生物安全柜中操作生物安全柜中操作将离心管上标记标本号; 每一管中加入10ml 完全PBS ，2g玻璃珠，1ml氯仿; 在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好 的离心管中（确认原始标本号与离心管上标记的编号 一致），剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于- 20。 拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20分钟。

5、将将离心管上标记标本号离心管上标记标本号; ; 每一管中加入每一管中加入1010mlml 完全完全PBSPBS ，2g2g玻璃珠，玻璃珠，1 1mlml氯仿氯仿; ; 在生物安全柜中在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约将每一份粪便标本取大约2 2g g加入加入标记好标记好 的离心管中（确认原始标本号与离心管上标记的编号的离心管中（确认原始标本号与离心管上标记的编号 一致），一致），剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于- - 2020。 拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡2020分钟。分钟。用冷冻离心机离心1500g*（约3500

6、转）20分钟。 将每一份标本上清吸入2个有外螺旋盖的标记好 的冻存管中（若上清不清澈，应再用氯仿处理 一次）。 将一管粪便悬液冻存于- 20作为备份，另一管 存于4-8以备接种（用于当天接种细胞）。 用冷冻离心机离心用冷冻离心机离心15001500g g* *（约约35003500转）转）2020分钟。分钟。 将每一份标本上清吸入将每一份标本上清吸入2 2个有外螺旋盖的标记好个有外螺旋盖的标记好 的冻存管中（若上清不清澈，应再用氯仿处理的冻存管中（若上清不清澈，应再用氯仿处理 一次）。一次）。 将一管粪便悬液冻存于将一管粪便悬液冻存于- - 2020作为备份，另一管作为备份，另一管 存于存于4

7、 4- -8 8以备接种（用于当天接种细胞）。以备接种（用于当天接种细胞）。2.脑脊液标本的处理- - - 通常直接用于病毒分离。 3.疱疹液标本的处理- - - 通常直接用于病毒分离。 4.咽拭子标本的处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右），以洗下 拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后4条件 下10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果 发现有细菌污染，用滤器过滤除菌。 5.眼结膜拭子标本的处理同咽拭子标本的处理。2.2.脑脊液标本的处理脑脊液标本的处理- - - - - 通常直接用于病毒分离。通常直接用于病毒分离。 3.3.疱疹液标本的处理疱疹液标本的处理- -

8、- - - 通常直接用于病毒分离。通常直接用于病毒分离。 4.4.咽拭子标本的处理咽拭子标本的处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（咽拭子要在保存液中充分搅动（4040下左右），以洗下下左右），以洗下 拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后4 4条件条件 下下1000010000rpmrpm离心离心2020minmin，用上清接种到细胞上，如果用上清接种到细胞上，如果 发现有细菌污染，用滤器发现有细菌污染，用滤器过滤除菌过滤除菌。 5.5.眼结膜拭子标本的处理眼结膜拭子标本的处理同同咽拭子标本的处理。咽拭子标本的处理。标本接种和观察标本接种和观察（病毒分离

9、病毒分离）标本接种和观察标本接种和观察（病毒分离病毒分离）标本接种和观察标本接种和观察（病毒分离病毒分离）A）所需试剂和耗材所需试剂和耗材： 细胞培养管培养的RD细胞和HEp- 2细胞； 维持液（MM）； 1ml和5ml的一次性塑料移液管A A）所需试剂和耗材所需试剂和耗材：所需试剂和耗材所需试剂和耗材： 细胞培养管培养的细胞培养管培养的RDRD细胞和细胞和HEpHEp- - 2 2细胞；细胞； 维持液（维持液（MMMM）；）； 1ml1ml和和5 5mlml的一次性塑料移液管的一次性塑料移液管B）操作步骤操作步骤： 显微镜下观察单层细胞- - 健康的单层细胞; 倒掉（GM），换上11.2ml

10、（MM）； 每一份标本同时接种2支RD细胞和2支HEp- 2细胞， 正确标记细胞管（包括标本编号、日期、传代数）； 每一种细胞至少标记一管作为阴性对照； 每支试管接种0.2ml标本悬液，培养温度要求36 （对于AHC标本病毒分离，尤其是EV70，强烈建议降 低培养温度，一般可为35）；B B）操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤： 显微镜下观察单层细胞显微镜下观察单层细胞- - - 健康的单层细胞健康的单层细胞; ; 倒掉（倒掉（GMGM），），换上换上11.211.2mlml（MMMM）；）； 每一份标本每一份标本同时同时接种接种2 2支支RDRD细胞和细胞和2 2支支HEpHEp- - 2 2

11、细胞，细胞， 正确标记细胞管（包括标本编号、日期、传代数）；正确标记细胞管（包括标本编号、日期、传代数）； 每一种细胞至少标记一管作为阴性对照每一种细胞至少标记一管作为阴性对照； 每支试管接种每支试管接种0.20.2mlml标本悬液，培养温度要求标本悬液，培养温度要求3636 （对于（对于AHCAHC标本病毒分离，尤其是标本病毒分离，尤其是EV70EV70，强烈建议降强烈建议降 低培养温度，一般可为低培养温度，一般可为3535）；）；使用倒置显微镜逐日观察并如实记录细胞培养管的 变化 ，至少一周。包括记录： CPE（1+4+）： （1+，25%; 2+, 25%50%; 3+, 50%75%;

12、 4+, 75%100%）； 细胞毒性反应; 细胞老化或污染. （ 7）关于肠道病毒CPE：即有特征性的肠道病毒致 细胞病变效应，表现为 细胞圆缩 、分散 、胞浆 内颗粒增加，折光性增强至细胞从管壁脱落。使用倒置显微镜逐日观察并使用倒置显微镜逐日观察并如实记录如实记录细胞培养管的细胞培养管的 变化变化 ，至少一周。包括记录：，至少一周。包括记录： CPECPE（1+4+1+4+）：）： （1+1+，25%; 2+, 25%50%; 3+,25%; 2+, 25%50%; 3+, 50%75%; 4+, 75%100%50%75%; 4+, 75%100%）；）； 细胞毒性反应细胞毒性反应; ;

13、 细胞老化或污染细胞老化或污染. . （ 7 7）关于肠道病毒关于肠道病毒CPECPE：即有特征性的肠道病毒致即有特征性的肠道病毒致 细胞病变效应，细胞病变效应，表现为 细胞表现为 细胞圆缩圆缩 、分散分散 、胞浆 内颗粒、胞浆 内颗粒增加增加，折光性增强至细胞从管壁脱落。折光性增强至细胞从管壁脱落。如果有特征性的肠道病毒CPE出现至观察到75%的 细胞发生变化（3+ CPE），冻存于- 20以备二次传 代。同一病例二次传代的病毒分离物其滴度高于一代 病毒，二代分离物可放到一起用于进一步鉴定； 第1代培养见可疑CPE至观察满7天后再继续冻融传 代，待CPE稳定出现后- 20或- 70冻存以备进

14、一步 鉴定；如果有特征性的肠道病毒如果有特征性的肠道病毒CPECPE出现至观察到出现至观察到75%75%的的 细胞发生变化（细胞发生变化（3+3+ CPECPE），），冻存于冻存于- - 2020以备二次传以备二次传 代。同一病例二次传代的病毒分离物其滴度高于一代代。同一病例二次传代的病毒分离物其滴度高于一代 病毒，二代分离物可放到一起用于进一步鉴定；病毒，二代分离物可放到一起用于进一步鉴定； 第第1 1代培养见代培养见可疑可疑CPECPE至观察满至观察满7 7天后再继续冻融传天后再继续冻融传 代，待代，待CPECPE稳定出现后稳定出现后- - 2020或或- - 7070冻存以备进一步冻存以

15、备进一步 鉴定；鉴定；如果如果7天之后没有天之后没有CPE出现出现，需盲传需盲传2代继续观察代继续观察。 （注意注意：同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传 代代）；）； 盲传盲传2代后仍不出现代后仍不出现CPE，则判定为阴性则判定为阴性； 注意注意：盲传不可超过盲传不可超过3代代。如果如果如果如果7 7天之后没有天之后没有天之后没有天之后没有CPECPE出现出现，需盲传需盲传出现出现，需盲传需盲传2 2代继续观察代继续观察。代继续观察代继续观察。 （注意注意：同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传（注意注意：同一病例

16、标本的不同细胞的培养物应单独传同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传 代代代代）；）；）；）； 盲传盲传盲传盲传2 2代后仍不出现代后仍不出现代后仍不出现代后仍不出现CPECPE，则判定为阴性则判定为阴性；则判定为阴性则判定为阴性； 注意注意：盲传不可超过盲传不可超过注意注意：盲传不可超过盲传不可超过3 3代代。代代。相关概念相关概念相关概念A：毒性反应毒性反应：如果在接种后12d内细胞快速地调亡，这可能是 由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。将这些已 接种标本的试管冻存于- 20，融化后取0.2ml接种到同一类型细 胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，可重取原始标 本用PBS稀释10倍，再