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1、(10)申请公布号 CN 102680704 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102680704 A *CN102680704A* (21)申请号 201210133900.4 (22)申请日 2012.04.28 G01N 33/68(2006.01) G01N 33/558(2006.01) (71)申请人 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 地址 510530 广东省广州市经济技术开发区 科学城开源大道 11 号科技企业加速器 A6 栋第三层 (72)发明人 罗琪 谢爱武 梁万兴 李必松 (74)专利代理机构 广州市越秀区海心联合专 利代理事务所 ( 普通合伙 ) 4429
2、5 代理人 黄为 (54) 发明名称 一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试 纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速定量检测微量白蛋白 的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件 及制备方法， 试纸条组件包括试纸条和独立包装 的铂卟啉标记特异抗体， 试纸条包括底衬、 吸水 垫、 包被分析膜及样品垫， 该包被分析膜上设有检 测线和质控线， 检测线包被的特异抗体为抗微量 白蛋白单克隆抗体， 质控线包被的特异抗体为兔 IgG 抗体 ； 铂卟啉标记特异抗体为抗微量白蛋白 单克隆抗体和抗兔 IgG 抗体 ； 检测卡组件包括试 纸条、 由盖板和背板组成的卡盒以及独立包装
3、的 铂卟啉标记特异抗体， 本发明检测人尿液中微量 白蛋白， 操作简单、 快速、 灵敏和特异性好， 且具有 良好的临床应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 10 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 10 页 附图 3 页 1/3 页 2 1. 一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其特征在于 ： 包括试纸条和 与试纸条配合使用且独立包装的铂卟啉标记特异抗体， 试纸条包括底衬、 依次接合在底衬 上的吸水垫、 包被分析膜及样品垫， 该包被分析膜上设有检测线和质控线， 检测线包被的特 异抗体为抗
4、微量白蛋白单克隆抗体， 质控线包被的特异抗体为兔 IgG 抗体 ； 铂卟啉标记特 异抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔 IgG 抗体。 2. 根据权利要求 1 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其特征在 于 ： 所述试纸条的所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶， 用于固定所述吸水垫、 包被分析膜及样 品垫， 其中所述包被分析膜粘附在所述底衬的中间， 所述底衬的两侧分别与所述吸水垫和 样品垫连接。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其特 征在于 ： 所述试纸条的所述吸水垫为一种滤纸， 该滤纸为吸水纸或滤油纸 ； 所述吸水垫粘 附在所述底
5、衬上， 同时所述吸水垫与所述包被分析膜重叠 1-2mm 连接。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其特 征在于 ： 所述包被分析膜由硝酸纤维素膜组成， 所述包被分析膜上喷涂抗微量白蛋白单克 隆抗体和兔 IgG 抗体。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其特 征在于 ： 所述样品垫为磷酸盐缓冲液浸泡过的玻璃纤维膜， 所述样品垫与所述包被分析膜 重叠 1-2mm 连接。 6. 根据权利要求 1 或 2 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其 特征在于 ： 所述独立包装的铂卟啉标记特异
6、抗体为抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔 IgG 抗 体， 并用含如下组分的 0.01-0.1M 磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得 ： 5 -20甘油、 1 -5牛血清白蛋白、 0.1-2甘氨酸和 0.01 -0.05表面活性剂。 7. 根据权利要求 1 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件， 其特征在 于 ： 所述独立包装的铂卟啉标记的激发光光源波长范围为 390-420nm， 发射光波长范围为 600nm-700nm。 8. 一种制备权利要求 1 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件的方 法， 其特征在于 ： 它包括以下步骤 ： 1) 抗体的制备 ： 选用纯化的基因工程
7、表达的抗微量白蛋白单克隆抗体、 抗兔 IgG 抗体和纯化的兔 IgG 抗体 ； 2) 包被分析膜的制备 ： 采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线， 划线细致均匀， 检测线与质控 线间隔 5mm ； 用检测线包被缓冲液稀释抗微量白蛋白单克隆抗体至浓度为 5-20ug/ml， 采用喷膜机 将抗微量白蛋白单克隆抗体喷印在硝酸纤维膜的检测线上 ； 用质控线包被缓冲液稀释纯化的兔 IgG 抗体至浓度为 5-20ug/ml， 采用喷膜机将纯化 的兔 IgG 抗体喷印在硝酸纤维膜的质控线上 ； 将喷膜后的硝酸纤维膜放入 30-50的真空干燥箱内， 干燥后取出密封备用 ； 3) 样品垫的制备 ： 权
8、 利 要 求 书 CN 102680704 A 2 2/3 页 3 用含 0.01 -0.5聚乙二醇、 1 -5牛血清白蛋白、 0.01 -0.05表面活性剂的 0.01-0.1M 磷酸盐缓冲液浸泡， 缓冲液 PH 为 7.2-7.6， 浸泡处理后， 将样品垫放入 65的真 空干燥箱内， 干燥 40-60 分钟后取出密封备用 ； 4) 免疫荧光试纸条的制备 ： 先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上， 在包被分析膜一端粘附吸水垫， 二者重叠 1-2mm ； 在包被分析膜另一端粘附样品垫， 二者重叠 1-2mm ； 再将黏贴好包被分析膜、 吸水垫 和样品垫的底衬裁切成细条 ； 5) 铂卟啉标记特异抗
9、体的制备 ： 将抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔 IgG 抗体， 分别用 0.05-0.2M、 pH9.5-11.0 碳酸氢 钠溶液稀释至 1-2mg/ml， 分别加入适量的铂卟啉溶解液， 搅匀， 室温孵育 1-2 小时， 孵育过 程中每隔 15-20 分钟分别混匀一次， 最后分别用规格型号为 G25 的凝胶柱过柱分离纯化， 分别收集铂卟啉标记好的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔 IgG 抗体， 各自用 0.01-0.1M、 pH7.2-7.6 磷酸盐缓冲液稀释混匀后于 -20保存 ； 6) 独立包装的铂卟啉标记特异抗体工作液的制备 ： 按照需要确定适当浓度的铂卟啉标记的抗微量白蛋白单克隆抗体和抗兔
10、IgG 抗体， 采 用含5-20甘油、 1-5牛血清白蛋白、 0.1-2甘氨酸、 0.01-0.05表面活性剂的 0.01-0.1M 磷酸盐缓冲液一并稀释， 分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖， 其中每个塑料试剂瓶 的分装量为 0.3-3ml， 在 2-8下保存。 9.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试 纸条组件的方法， 其特征在于 ： 检测线包被缓冲液的制备方法为 ： 用 20mM、 pH7.6 的磷酸盐 缓冲液稀释， 使含甲醇 1.0、 蔗糖 1.5、 牛血清白蛋白 0.6的抗微量白蛋白单克隆抗体 的浓度至 1mg/ml ； 质控线包被缓冲液的制备方法 ：
11、用 50mM、 pH7.6 的聚丁烯缓冲液稀释， 使 含甲醇 0.7、 牛血清白蛋白 0.5的兔 IgG 抗体的浓度至 0.5mg/ml ； 包被分析膜的制备 ： 调试喷膜机， 膜液量为 25ul/40cm， 机器划线， 检测线与质控线间隔 5mm， 划线细致均匀， 放 置 25 -37真空干燥箱处理 1.5 小时， 装袋密封备用。 10. 如权利要求 8 所述的制备权利要求 1 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光 试纸条组件的方法， 其特征在于 ： 铂卟啉标记特异抗体的制备中的标记抗微量白蛋白单克 隆抗体和抗兔 IgG 抗体的铂卟啉标记的铂卟啉溶解液为 30-50mg。 11. 如权利要
12、求 8 所述的制备权利要求 1 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光 试纸条组件的方法， 其特征在于 ： 样品垫的制备中， 用含 0.4聚乙二醇、 1.5牛血清白蛋 白、 0.02表面活性剂的 0.02M 磷酸盐缓冲液浸泡， 将浸泡后的所述样品垫放入 65真空 干燥箱内， 干燥 40-60 分钟后取出密封备用。 12. 一种由权利要求 1 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的 检测卡组件， 其特征在于 ： 包括试纸条、 由用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和用聚苯乙烯 或聚氯乙烯制成的背板组成的卡盒以及独立包装的铂卟啉标记特异抗体， 所述背板包括放 置试纸条的卡槽和用于与盖板结
13、合的卡齿， 所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、 可滴 加样品的加样孔和用于与背板的卡齿结合的固定孔， 所述试纸条通过所述卡齿与所述固定 孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间， 其中， 所述包被分析膜正对所述检测窗， 所述样 品垫正对所述加样孔 ； 另外， 独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封 权 利 要 求 书 CN 102680704 A 3 3/3 页 4 瓶盖。 13. 一种制备权利要求 8 所述的快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件制成 的检测卡组件的方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： 1) 制成背板和盖板 ： 用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板
14、， 所述背板包括放置所述试纸条的 卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿， 所述盖板包括可观测结果的检测窗、 可滴加样品的加 样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔 ； 2) 组装 ： 将试纸条放在所述背板的所述卡槽内， 通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结 合， 将试纸条嵌合在背板和盖板之间， 其中， 包被分析膜正对所述检测窗， 样品垫正对所述 加样孔， 另外， 独立包装的铂卟啉标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。 3) 包装 ： 将 1 人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内， 并配备 1 瓶独立包装的铂卟啉 标记特异抗体， 将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入
15、一个包 装盒， 在 2 -8环境下避光不冻存的进行保存。 权 利 要 求 书 CN 102680704 A 4 1/10 页 5 一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试纸条组件及其 制成的检测卡组件和制备方法 技术领域 0001 本发明属于医学检验领域， 具体涉及一种快速定量检测微量白蛋白的免疫荧光试 纸条组件及其制备方法。 背景技术 0002 血清白蛋白部分可由肾小球通过， 但几乎皆被肾小管重吸收， 当肾小球病变时其 滤过量增多， 以致超过肾小管的重吸收而从尿中排出， 便形成尿微量白蛋白(MA)。 尿微量白 蛋白是指尿中白蛋白的排泄率每分钟超过 20g 或 24h 超过 30mg， 浓度为
16、30-200mg/L， 用常 规方法无法检出。 大量研究已证明尿微量白蛋白阳性是肾损伤尤其是肾小球损伤的早期标 志， 其排出量的多少与肾小球基底膜损伤的程度呈正相关， 与 1 型糖尿病、 2 型糖尿病的预 后有密切关系。近年来的大量研究表明， MA 同时也是高血压、 冠心病、 自身免疫性疾病等造 成肾损伤的早期诊断指标， 在临床上受到越来越广泛的重视。 0003 糖尿病 (DM) 患病率逐年增加， 早期发病多隐匿无症状， 晚期因严重并发症而危及 人的健康和生命， 因此， 其早期发现、 诊断和治疗至关重要。对糖尿病患者尿分别用于化学 试纸法进行蛋白定性及免疫透射比浊法进行尿微量白蛋白定量检测， 结果发现， 尿蛋白定 性试验的阳性率仅为8.46， 而尿微量白蛋白的阳性率为53.7， 说明MA的检测更能及早 地提示糖尿病性肾损伤。 0004 近年来， 有关原发性高血压的研究越来越深入， 特别是高血压造成的靶器官损害 已成为中老年人致死致残的主要因素， 业已证明， 高血压也是加重肾功能恶化的重要因素
