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1、广西中医药科学实验中心广西中医药科学实验中心 张张 玲玲 办公室电话：办公室电话：3946492 ELISA 知识简介 ELISA ELISA 的发展历程的发展历程 ELISA ELISA 的原理的原理 ELISA ELISA 的类型的类型 ELISAELISA的试剂准备的试剂准备 ELISAELISA操作注意事项（视频）操作注意事项（视频） 一、 ELISA 的发展历程 免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫 分析之后发展起来的一大新型的分析之后发展起来的一大新型的血清学技术血清学技术。 19661966年，年，NakaneNakane和和A
2、vrameasAvrameas等分别报道用酶代替等分别报道用酶代替 荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（enzymeenzyme- - labelled antibody techniquelabelled antibody technique），用于生物组织中抗），用于生物组织中抗 原的定位和鉴定。原的定位和鉴定。 19711971年，年，Engvall Engvall ，Van Weemen Van Weemen 等报道了酶联免等报道了酶联免 疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。 2020世纪世纪8
3、080年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分 子的免疫转印技术问世，目前，免疫酶标记技术已子的免疫转印技术问世，目前，免疫酶标记技术已 成为成为免疫诊断免疫诊断、检测检测和和分子生物学分子生物学研究中应用最广研究中应用最广 泛的免疫学方法之一。泛的免疫学方法之一。 二、ELISA 的原理 ELISAELISA是以是以免疫学反应免疫学反应为基础，将抗原、抗体为基础，将抗原、抗体 的的特异性反应特异性反应与与酶对底物的高效催化酶对底物的高效催化作用相结作用相结 合的一种合的一种 敏感性很高的实验技术。敏感性很高的实验技术。 基础基础: :抗原或抗体的固相化及抗原或抗体
4、的酶抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶 标记。标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保 持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留 其免疫学活性，又保留其酶的活性。其免疫学活性，又保留其酶的活性。 测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗 体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗体，加入体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗体，加入 酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由
5、 此进行定性或定量分析。此进行定性或定量分析。 三、ELISA的试剂 ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物 和酶的底物。和酶的底物。 （1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附 剂）；剂）； （2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3 3）酶的底物；）酶的底物； （4 4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液； （6 6）洗涤液；）洗涤液； （7 7）酶反应终止液（
6、注意防腐蚀）酶反应终止液（注意防腐蚀） 免疫吸附剂免疫吸附剂 固相载体固相载体-聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性 能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。免疫学活性。 聚氯乙烯聚氯乙烯-聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯 乙烯高，但空白值也略高。乙烯高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好，空白值低，吸附性能好，空白值低， 孔底透明度高孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同，各板之间、同一板各孔之间、同 一板各孔之间性能相近。一板各
7、孔之间性能相近。 包被用抗原：包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工是抗原决定簇的氨基酸序列人工 合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇， 纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往 往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固 相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 包被用抗体 IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对
8、聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，段上， 抗体结合点暴露于外。抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除须除去杂抗去杂抗 体体后才能用于后才能用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需，因此不需 要作吸收层析处理，要作吸收层析处理，直接包被直接包被。在某些情况下，用。在某些情况下，用 多种单抗混合包被，可取得更好的效果。多种单抗混合包被，可取得更好的效果。 封闭 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之
9、后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关 蛋白质溶液再包被的过程。蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不封闭就是让大量不 相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA 后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%0.05%- -0.5%0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血的小牛血 清或清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度比较价廉，可以高浓度 使用（使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭。固相均需封闭。 结合物用的抗原和抗体
10、结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgGIgG，以免在与酶联结，以免在与酶联结 时其他杂蛋白的干扰。最好用时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体层析纯化的抗体，这，这 样样全部酶结合物均具有特异的免疫活性全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高，可以在高 稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用中用 酶标抗原的模式不多，酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯总的要求是抗原必须是高纯 度的度的。 酶酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质，性质 稳定
11、，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在 相同的酶。相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制 备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，葡萄糖，葡萄糖氧化酶，氧化酶， - -D D- -半乳糖半乳糖 苷酶和脲酶等。苷酶和脲酶等。 HRPHRP是一种是一种糖蛋白糖蛋白，含糖量约为，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为 4400044000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅
12、基（亚铁血红素）结合而成，基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质是一种卟啉蛋白质。 底物底物 HRP的底物 DH2+ H2O2 DH2+ H2O2 D D+ 2H2O+ 2H2O 上式中，上式中， DH2DH2为供氢体，为供氢体， H2O2H2O2为受氢体。为受氢体。 DH2DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺(TMB)(TMB)等。等。 OPDOPD氧化后的产物呈氧化后的产物呈橙黄色橙黄色，用酸终止酶，用酸终止酶 反应后，呈棕黄色，在反应后，呈棕
13、黄色，在492nm492nm处处有最高吸有最高吸 收峰，灵敏度高，比色方便，是收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合结合 物最常用的底物。物最常用的底物。 TMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显作用后共产物显蓝色蓝色。TMBTMB性质性质 较稳定，可配成溶液试剂，只需较稳定，可配成溶液试剂，只需与与H H2 2O O2 2溶溶 液混和即成应用液液混和即成应用液。酶反应终止后，。酶反应终止后，TMBTMB 产物由产物由蓝色呈黄色蓝色呈黄色，可在比色计中定量，可在比色计中定量， 最适吸收波长为最适吸收波长为450nm450nm。 底物系统 与HRP反应 后的颜色 加终止液后 的颜色 读数
14、波长 特 点 OPD 492nm 药片现配， 致畸， 但本底好 TMB 450nm A,B液操作 方便， 本底较高 荧光，化 学发光等 需要 仪器检测 灵敏度高， 仪器昂贵 、ELISAELISA的类型的类型 在实际应用中，通过不同的设计，具体的在实际应用中，通过不同的设计，具体的 方法步骤可有多种。即方法步骤可有多种。即: :用于检测抗原的用于检测抗原的双双 抗体夹心法抗体夹心法( (图图a)a)、用于检测抗体的、用于检测抗体的双抗原双抗原 夹心法夹心法( (图图b)b)、用于检测抗体的、用于检测抗体的间接法间接法( (图图c) c)、 以及用于检测小分子抗原或半抗原的以及用于检测小分子抗原
15、或半抗原的抗原抗原 竞争法竞争法( (图图d)d)等等。比较常用的是等等。比较常用的是ELISAELISA双抗双抗 体夹心法及体夹心法及ELISAELISA间接法。间接法。 优点：操作方便，实验可靠。优点：操作方便，实验可靠。 双抗体夹心法示意图（图a） 固相载体 抗体 抗原 酶 抗体 酶标记抗体 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。 4.酶催化底物并显色。 双抗原夹心法示意图（图b） 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，
16、则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。 4.酶催化底物并显色。 酶 抗原 酶标记 抗原 抗体 抗原 固相载体 酶 抗抗 体 酶标记 抗抗体 抗体 抗原 固相载体 1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结 合为抗原-抗体-酶标记抗抗体 复合物。 4.酶催化底物并显色。 间接法示意图（图c） 酶标抗原竞争法示意图（图d） 固相载体 抗体 抗原 酶 酶标记抗原 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则优先 竞争结合抗体，结合 为抗原抗体复合物。 3.同时加入酶标记抗原，抗原 没有结合的位点酶标记抗原 去占据，则结合为酶标记抗 原-抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 抗原 五、基本操作注意事项五、基本操作注意事项 标本的采取和保存标本的采取和保存
