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1、黄曲霉毒素的检测及防控,Analysis and Control of Aflatoxins,内 容,黄曲霉毒素的概述 黄曲霉毒素的国际限量要求 黄曲霉毒素的检测 黄曲霉毒素污染的预防和控制 山东局技术中心黄曲霉毒素实验室 输欧花生黄曲霉毒素实验室检测,一、黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素的研究历史 黄曲霉毒素的毒理作用 黄曲霉毒素的产生 黄曲霉毒素的分布 黄曲霉毒素的化学性质,研究历史,1960年, 英国10万只火鸡死亡事件揭开了人们对于黄曲霉毒素的认识与研究。 火鸡的死亡与饲料中含有较高浓度的黄曲霉毒素有关。 用这种饲料（花生粉）对动物进行急性毒理实验后，证明具有强毒性。对大白鼠进行长期的慢性中
2、毒实验后，成功地诱发了肝癌。 对毒饲料进行提取，得到了黄曲霉毒素。 在随后的几十年中，黄曲霉毒素得到了科学界的高度重视。,黄曲霉毒素的毒理作用,黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素。当大剂量摄入这些毒素时可能是致命的。亚致死剂量会导致慢性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是导致肝癌。通常，动物幼仔比成年动物更加容易遭受黄曲霉毒素的毒害。黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注，是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的致癌原。,黄曲霉毒素的产生,黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等在代谢过程中产生。 黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度
3、和基质的含水量）、温度（24-30度）、氧气（1%以上）、培养时间、机械损伤、昆虫损害等。,黄曲霉毒素的分布,黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2大多分布在农产品中，常见的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等。 黄曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中。 在哺乳动物的肝脏与尿中发现了黄曲霉毒素P1和Q1。,黄曲霉毒素的化学性质,黄曲霉毒素是结果相近的一群衍生物。化学结构式为二呋喃环和香豆素。在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。 黄曲霉毒素的分解温度为237-299度，一般加热不能破坏其毒性。 在有氧条件下，紫外线照射可去毒。 难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿
4、等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强碱溶液下易分解,黄曲霉毒素 B1同肝细胞DNA的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞 生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤。,二、黄曲霉毒素的国际限量,Codex,花生(未加工): 黄曲霉毒素总量 15ppb 牛奶: 黄曲霉毒素M1 0.5ppb,EU,黄曲霉毒素B1/总量花生、坚果、干果： 2/4ppb 花生（进一步挑选等）：8/15ppb 坚果、干果（进一步挑选）：5/10ppb 谷物及加工产品：2/4ppb 各种调味品：5/10ppb,澳大利亚、新西兰,黄曲霉毒素总量： 花生：15ppb,美国,所有食
5、品： 黄曲霉毒素总量 20ppb,黄曲霉毒素的中国限量,玉米、花生、花生油、坚果等 B1不得超过20ppb。 大米、其他食用油等B1不得超过10ppb。 其它粮食（麦类、面粉、薯干）、发酵食品（酱油、醋等）、淀粉类制品（糕点、饼干、面包等） B1不得超过5ppb。 牛奶及其制品中M1不得超过0.5ppb。,三、黄曲霉毒素的检测,黄曲霉毒素的检测，从广义上，包括：采样、制样和检测三个过程。黄曲霉毒素的检测一直是困扰世界各国的难题。原因：不均匀分布；ppb水平,检测程序analytical procedure,采 样,样品制备/分样,分析检测,采样 sampling,目的：得到一个有代表性的样品
6、困难：1）分布不均匀2）ppb水平 办法：尽量加大采样点和采样量，使货物的每个部位都有同等的机会被抽到。,均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素）,所谓“ppb”1，000，000，000中的1分子32年中的1秒地球至月球总距离中的40cm22公斤沙子中的1粒3.5车厢中的1粒玉米,检测误差 Errors in Analysis,集装箱,样品,小样,检测,100%总误差,88%采样误差,10%制样误差,2%检测误差,Whitaker Dicken，1974,针对卡车或拖车装载玉米的取样方式: 第一次取样的位点标记为 “O”. 如果需要更多的样品，应在标记为 “X”的位点再次取样,取样方式
7、,一卡车玉米中有20ppb黄曲霉毒素的污染,样品制备 sample preparation,目的：将样品充分粉碎、均质化，为下一步检测做准备 办法：使用高效粉碎机，粉碎最终直径小于2mm 制样误差约占总误差的10%,分析检测 test,提取extraction 净化purification 分析analysis,分析程序 - 提取使用甲醇/水或乙腈/水混合液萃取研磨样品,使用搅拌机(2-5 Minutes)或震荡仪 (30-180 Minutes)震荡萃取液.,样品液数量与溶剂数量存在最 佳比例。注意所使用的有毒溶剂对健康的损害及污染,分析程序-净化,净化是指去除提取液中的杂质（如脂肪、蛋白质
8、、色素等），以避免对黄曲霉毒素的检测造成干扰。,几种常用的净化方法,免疫亲和柱 (IAC)净化 固相萃取柱（SPE）净化 液-液萃取 其他,黄曲霉毒素的分析方法,快速筛选法：荧光光度计法ELISA法 确证方法：HPLC-FLD法,免疫亲和柱净化-荧光光度计法,原理：紫外线照射后，黄曲霉毒素能发射特征荧光 优点： 1、操作简便、安全 2、检测限小于2ppb 缺点：有假阳性的存在,酶联免疫法,原理：利用抗原抗体反应并由酶催化底物产生颜色进行定量的分析方法 优点： 1、操作简便、成本较低2、有些商品化的试剂盒检测限能达到1ppb缺点：有假阳性的存在,方法的选用,经过筛选方法检测的样品，可以继续通过基
9、准方法进一步确证黄曲霉毒素的存在，并进行更加准确的定量检测。,四、黄曲霉毒素的预防与控制,预防 prevention 采样 sampling 样品制备 sample preparation 样品提取 extraction 测试需求评价 evaluation of testing requirements 检测 testing 结果确证 result validation 文本化 documentation 供货方介入 supplier involvement 去毒 removal,五、山东局技术中心生物毒素实验室介绍,1. A professional Mycotoxin laboratory
10、.一个专业化的官方实验室 2. A long history to detect Aflatoxin.检测黄曲霉毒素历史悠久,Introduction,悠久的历史,Use biology method since 1970s. Use TLC method since 1980s. Use HPLC method since 1990s,生物毒素检测业务,& 实验室认可,STCIQ is accredited by China national accreditation service for Conformity Assessment (CNAS) and operated in acco
11、rdance with ISO/IEC 17025:2005 (E) General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.,FAPAS 成绩,组织国内能力验证活动 1,时间 : 2002年 Analyse: 花生酱中的黄曲霉毒素 组织者: CCIBLAC 轮次 : 国认实函200117号 参加实验室数 : 63,组织国内能力验证活动 2,时间 : 2005 Analyse: 花生酱中的黄曲霉毒素 组织者: 国家食品安全局 Round: 质检食函2005082号 参加实验室数 : 15,组
12、织国内能力验证活动 3,日期: 2005 Analyse: Aflatoxin Analysis in Peanut paste 组织者: 山东局 Round: 鲁检便食字第077号 Attended Laboratory Number : 52,组织国内能力验证活动 4,Date: 2006(on going) Analyse: Aflatoxin Analysis in Peanut paste Sponsor: CNAS Round: CANS T0339 Attended Laboratory Number : 74,组织国内能力验证活动 5,Date: 2006 Analyse: A
13、flatoxin Analysisin Peanut paste Sponsor: 山东局 Round: Attended LaboratoryNumber : 89,六 输欧花生黄曲霉毒素的实验室检测工作,& （黄曲霉毒素的检测流程）Flow chart of Aflatoxin analysis,接样 Sample receive 样品登记 Sample register样品制备 Sample preparation净化 Sample clean up测定 Sample HPLC determination报告 Report留样、记录 Reserve samples and records
14、,接样 (1),Is it sealed ? Is it clearly labelled ? Is it weigh about 30kg ?,Sample receive (2),样品登记,分 样,Samples must be Thoroughly mixed before divided into three Sub-samples,样品制备 、样品均匀性测试 Sample preparation,实验室样品、留存样品 Sample preparation record,实验室前处理Sample Clean-up,仪器测定 HPLC Determination,如何保证检测结果的准确？
15、 实验室质量控制,1、样品制备过程：定期进行样品均匀性核查 2、实验室检测过程：日常检测采用加标回收和质控样品加标回收质控样品 3、每年参加国际间实验室能力验证活动,检 测 报 告 的 格 式 与 解 释,1、 方法的检出限（LOD） 2、方法的检测限（LOQ） 3、 回收率（Recovery） 4、 不确定度（ Uncertainty）,报告中的检出限、检测限,针对GB/T 18979-2003方法检出限是0.3ppb，检测限是1.0ppb报告的三种情况：未检出： 低于检出限 1.0 ppb ：检出了，但不能准确定量实际值： 能准确定量,回 收 率,检测结果与真实值 Recovery（100
16、%）= 检测结果 / 真实值如何得到真实值？ 1）购买有证样品（质控样品） 2）空白添加已知浓度的标样 （质控样品）将待测样品与质控样品同批检测，计算回收率。,报告中的回收率校准,样品1与质控样品（样品A）同批检测，样品A的实际值为2.0ppb。 结果：样品1的检测结果为3.0ppb，样品A的检测结果为1.8ppb。 回收率计算：1.8/2.0=90% 样品1的实际值为：3.0ppb/0.9=3.3ppb,如何理解报告中的不确定度？,报告中：本方法的扩展不确定度 (在95%可信区间): B1为20%，总量为20%。如何理解？ 结果 不确定度（U） U(B1)=0.20B1“检测值” U(总量)=0.20总量“检测值” 假设实际值：B1= 1.8ppb1.8 1.8 20%=1.8 0.4 （1.4，2.2）该样品中的黄曲霉毒素B1的最佳估计值是1.8ppb，它在1.4 - 2.2ppb的范围内。,
